论文题目: 荷斯坦奶牛细胞因子基因的克隆、表达及重组蛋白的应用
论文类型: 博士论文
论文专业: 预防兽医学
作者: 张灿
导师: 汪明
关键词: 原核表达,免疫佐剂
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究从荷斯坦奶牛的外周血淋巴细胞中经ConA刺激提取总RNA,通过RT-PCR的方法克隆了IL-2、IL-6和GM-CSF三个基因,连接载体T-easy,测序结果显示:IL-2与已登录的基因序列完全相同;IL-6和GM-CSF与GneBank中的序列存在点变异。氨基酸序列分析表明三种细胞因子α螺旋在50%以上,有1-2个糖基化位点。 从PMD-18/VP1质粒中亚克隆FMDV抗原基因VP1,构建原核表达质粒pGEX-6p-1/VP1;亚克隆IL-2、IL-6和GM-CSF三个成熟肽基因,分别构建原核表达质粒pGEX-6p-1/BoIL-2,pGEX-6p-1/BOIL-6,pGEX-6p-1/BoGM-CSF;分别构建VP1基因与1-2个细胞因子基因共表达质粒 pGEX-6p-1/BolL-2/VP1,pGEX-6p-1/BolL-6/VP1,pGEX-6p-1/BoGM-CSF/VP,pGEX-6p-1/BoIL-2/IL-6/VP1,pGEX-6p-1/BoIL-2/GM-CSF/VP1,基因之间用linker连接,分别在大肠杆菌RS21中表达,30℃ IPTG诱导表达出相应蛋白:蛋白以包涵体的形式存在,表达量占菌体总蛋白的37%以上,纯化后蛋白纯度达到90%以上;生物活性测定结果表明,IL-2对小鼠的胸腺细胞有刺激活性,GM-CSF对小鼠的骨髓细胞有刺激活性。 将豚鼠随机分为17组,每组5只,将表达的重组蛋白免疫各组,每隔2周免疫一次,共免疫3次。每次免疫后2周采血分离血清,ELISA测定血清抗体效价;用中和抗体阻断试剂盒测定中和抗体:末次免疫后2周分离脾脏淋巴细胞,用MTT法进行T细胞增殖试验;通过半定量RT-PCR检测细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-5和IL-10表达水平;试验结束前三天进行迟发型超敏反应试验。豚鼠试验结果表明,与生理盐水对照组比较,免疫组血清IgG抗体水平显著升高,T细胞增殖反应显著增强,抗原特异性迟发型超敏反应(DHT)强烈,Th1型和Th2型细胞因子表达量都有不同程度的升高。各免疫组之间比较,两种细胞因子与VP1联用的融合蛋白和混合蛋白的四个免疫组免疫效果最好;单个细胞因子与VP1联用的六个免疫组效果次之,VP1、VP1+佐剂和灭活苗组与以上六组效果相当。在各免疫组中,共表达蛋白组和混合蛋白组免疫效果相当,没有明显的差别。中和试验结果表明,BOIL-2,BOIL-6组没有产生明显的中和抗体,其他各组都能刺激产生高水平的中和抗体;与VP1组比较,BoGM-CSF,BoIL-2/VP1,BolL-6/VP1,BoGM-CSF/VP,BoIL-2+VP1,BoIL-6+VP1,BoGM-CSF+VP,BoIL-2/IL-6/VP1,BoIL-2+BoIL-6/VP1,中和抗体水平较高,但没有达到显著差异,BoIL-2/GM-CSF/VP1,BoIL-2+BoGM-CSF/VP1免疫组中和抗体水平显著增高;与灭活苗组比较,BoIL-2/GM-CSF/VP1,BoIL-2+BoGM-CSF/VP1免疫组刺激产生的中和抗体滴度和灭活苗组中和抗体滴度相当。通过ELISA试验、T细胞增殖试验、中和抗体试验、迟发型超敏反应试验以及半定量PCR试验检测三种细胞因子作为分子免疫佐剂与VP1联用的效果,试验结果表明用VP1免疫,GM-CSF作为分子佐剂的效果最好:IL-2比IL-6的佐剂效果好;两种细胞因子联合的佐剂效果比单个细胞因子的佐剂效果好。
论文目录:
文献综述
文献综述一 细胞因子的研究进展
文献综述二 细胞因子免疫佐剂在口蹄疫基因工程苗中的应用
试验研究
第一部分 荷斯坦奶牛细胞因子基因的克隆及其序列分析
1.引言
2.材料与方法
3.结果
4.讨论
5.小结
第二部分 荷斯坦奶牛细胞因子的原核表达及生物活性分析
1.引言
2.材料与方法
3.结果
4.讨论
5.小结
第三部分 重组细胞因子对FMDV基因工程苗免疫效果的研究
1.引言
2.材料与方法
3.结果
4.讨论
5.小结
结论
参考文献
致谢
个人简介
附录
发布时间: 2005-07-18
参考文献
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