污染环境中特定功能微生物多样性调查研究

论文摘要

为了解富营养、氮素污染严重的胶州湾海域反硝化细菌群落的结构与组成,应用PCR技术为基础的基因文库方法对胶州湾沉积物反硝化细菌nirS基因的分子多样性进行研究。5个站位共筛选了331个克隆,分别属于132个不同的分类操作单元（Operational Taxonomic Units,OTUs）。各个站位OTUs个数30～44不等,显示了较高的多样性。nirS基因序列与GenBank数据库中最相似序列的相似度在62～100%。系统进化分析表明,包括波罗的海、墨西哥湾等12大海域和河口的沉积物或水体的nisS基因序列可被划分为7个簇（Marine ClusterⅠ-Ⅶ）,其中MarineClusterⅦ在序列50%相似度水平上又可划分为7个亚簇。其中Marine ClusterⅦg是本研究中特有的亚簇,体现了胶州湾沉积坏境具有不同于其他海域的反硝化细菌基因序列。基于OTUs在各站位的分配和nirS基因序列系统进化关系,对各站位反硝化细菌群落结构进行Cluster Environments、Jackknife Cluster和PCA聚类,结果表明A5、Y1、D1站位反硝化细菌群落关系接近,B2、C4站位关系较远。结合环境因子聚类分析结果,揭示胶州湾沉积物反硝化细菌群落结构与沉积物粒度等多种环境因子相关。陆源污染、河流输入以及水动力条件是影响样地反硝化基因多样性的重要因素。大量抗生素药物的滥用及不合理排污,使得水环境中耐药细菌危害日益严重,为了了解胶州湾耐药细菌污染情况及耐药基因的传播途径,以胶州湾土霉素抗性菌为背景,共筛选得到具有氨苄青霉素抗性细菌66株。采用多重PCR方法,对超β-内酰胺酶（ESBLs）和质粒介导的AmpC酶进行检测,结果表明TEM,SHV是其优势基因型。16S rRNA基因序列分析显示,携带β-内酰胺酶基因的多重耐药菌中93.8%都属肠杆菌群。同时以筛选得到的32株产β-内酰胺酶多重耐药菌为对象研究其传播途径,发现68.8%的多重耐药菌携带整合子,其中Ⅰ类整合酶占有优势。整合子已成为胶州湾多重耐药细菌的主要传播机制。分析表明β-内酰胺抗性细菌空间分布差异较大。胶州湾独特的地理特点、陆源污染和人为活动是影响其耐药细菌分布的主要因素。耐药细菌及其基因分布信息可作为一种生物指示,对揭示海岸环境质量或污染源有潜在作用。为解决渤海海域石油污染日益严重的情况,从大连石化隔油池污水中分离、纯化得到一株以柴油为唯一碳源的石油降解菌DW-1。生理生化性状和Biolog分析结果表明该菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。正交实验结果表明,pH 8.5,盐度30‰,氮磷质量比10:1为该菌株最适生长条件。在油培养基浓度3g/L,菌龄为48h的细菌进行接种,平均除油率在70%左右,最高可达80.32%,降解过程中将柴油乳化为小油滴吸附在其表面。海水培养基中絮状物薄而透且形状较大,表明该菌株具有应用于海洋石油污染治理的潜质。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 微生物多样性
• 1.1.1 微生物多样性研究方法
• 1.1.2 功能基因在微生物生态中的应用
• 1.2 反硝化功能微生物
• 1.2.1 海洋系统中氮素的生物地球化学循环
• 1.2.2 反硝化作用
• 1.2.2.1 微生物参与的反硝化过程
• 1.2.2.2 反硝化细菌的作用机理
• 1.2.3 氮污染
• 1.2.4 反硝化细菌群落结构与环境的关系
• 1.2.5 反硝化细菌多样性研究现状
• 1.3 抗药性微生物
• 1.3.1 细菌耐药性产生
• 1.3.2 细菌耐药性扩散机制
• 1.3.3 β-内酰胺酶研究
• 1.3.4 超广谱β-内酰胺酶研究进展
• 1.3.5 质粒介导头孢菌素酶AmpC的研究进展
• 1.3.6 基因盒—整合子系统研究进展
• 1.3.7 水环境耐药细菌污染现状研究
• 1.3.8 水环境耐药细菌的监测
• 1.4 石油烃降解微生物
• 1.4.1 石油烃的生物降解
• 1.4.2 降解石油烃的微生物
• 1.4.3 微生物对石油烃的降解机理
• 1.4.4 石油烃生物降解的影响因素
• 1.4.5 石油污染生物修复的强化措施
• 第2章 胶州湾沉积物反硝化细菌多样性研究
• 2.1 实验材料及仪器设备
• 2.1.1 样品采集
• 2.1.2 环境因子的测定
• 2.1.3 主要培养基
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 分子生物学相关试剂盒
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 nirS基因文库建立
• 2.2.2 基因文库克隆及序列测定
• 2.2.3 nirS基因序列的统计学及系统进化分析
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 样品环境因子
• 2.3.2 nirS基因限制性酶切分析
• 2.3.3 覆盖率和稀释曲线分析
• 2.3.4 聚类分析
• 2.3.5 多样性指数分析
• 2.3.6 反硝化细菌nirS基因序列系统进化分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 基因文库方法研究细菌多样性的优缺点
• 2.4.2 胶州湾反硝化功能基因系统进化分析
• 2.4.3 胶州湾反硝化细菌群落结构与环境关系分析
• 2.5 小结
• 第3章 胶州湾氨苄青霉素耐药细菌抗性基因及其传播机制研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 氨苄青霉素抗性细菌筛选
• 3.2.2 氨苄青霉素抗性细菌的多重抗药性实验
• 3.2.3 产超广谱β-内酰胺酶的PCR检测
• 3.2.4 质粒型AmpC β-内酰胺酶基因PCR扩增
• 3.2.5 携带β-内酰胺酶基因菌株的16S rRNA基因扩增和系统进化分析
• 3.2.6 第Ⅰ、Ⅱ类整合酶及其耐药基因盒的PCR检测
• 3.2.7 第Ⅰ、Ⅱ类整合酶测序
• 3.2.8 第Ⅰ、Ⅱ类整合子可变区基因盒测定
• 3.2.9 序列提交
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 氨苄青霉素抗性细菌药敏实验检测结果
• 3.3.2 β-内酰胺酶抗性基因的PCR检测
• 3.3.3 16S rRNA基因测序结果和系统进化分析
• 3.3.4 整合酶及耐药基因盒PCR检测
• 3.4 讨论
• 3.4.1 胶州湾肠道细菌污染
• 3.4.2 胶州湾耐药微生物分布
• 3.4.3 胶州湾β-内酰胺酶抗性基因分布
• 3.4.4 胶州湾整合子检测结果分析
• 3.4.5 胶州湾耐药基因盒检测结构分析
• 3.5 小结
• 第4章 石油降解菌的筛选及降解特性研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 培养基及培养条件
• 4.1.2 实验样品及仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 菌种分离
• 4.2.2 菌株鉴定
• 4.2.3 石油降解率的测定
• 4.2.4 菌株性能研究
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 菌种的分离、鉴定
• 4.3.2 菌株生长曲线
• 4.3.3 油浓度对降解率的影响
• 4.3.4 接种量对降解率的影响
• 4.3.5 pH对油降解率的影响
• 4.3.6 不同时间培养液pH变化
• 4.3.7 菌株对不同碳源的利用性
• 4.3.8 菌株的最适生长条件
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间公开发表论文
• 致谢
• 研究生履历