首页> 正文

霍乱毒素B亚基和小麦小孢子特异表达β-expansin基因的表达研究

2020-11-22阅读(674)

霍乱毒素B亚基和小麦小孢子特异表达β-expansin基因的表达研究

论文摘要

1. 霍乱毒素B亚基在家蚕杆状病毒表达系统的表达与活性分析 霍乱毒素B亚基（cholera toxin B submit,CTB）是霍乱毒素的无毒单位,具有很强的免疫原性,能刺激机体产生黏膜IgA和血清IgG抗体。B亚单位的主要功能是与有核细胞上的GM1-神经结苷脂结合而使得A亚单位进入细胞,这个功能使它在免疫佐剂、口服疫苗与多肽衍生疫苗的研究中具有越来越重要的作用。 在本论文中,霍乱毒素B亚单位与多角体蛋白的融合基因被克隆至昆虫杆状病毒表达载体系统（BEVS）的转移载体pBacPAK8中,使其置于多角体蛋白（polyhedrin）基因启动子控制之下,获得重组转移载体pBacPAK-mCTB。重组转移载体DNA与经Bsu36I酶切线性化的修饰型病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,然后经空斑纯化、PCR扩增、Southern杂交等方法鉴定出含CTB基因的重组病毒BacPAK-mCTB。将重组病毒BacPAK-mCTB感染BmN细胞及五龄幼虫, SDS-PAGE电泳分析显示重组杆状病毒的116kD的β-半乳糖苷酶条带缺失,证实外源基因已成功取代了LacZ基因:Western blotting分析发现在14kD及70kD处有分别都有明显条带。其表达的融合蛋白产物经ELISA检测显示细胞和虫体表达分别为5.6μg/ml54.4μg/ml.在蚕体中得到了高效表达:而GM1-ELISA说明CTB五聚体的结合GM1-神经结苷脂的生物学功能。NOD小鼠的免疫增强实验则明显的反映了CTB的免疫试剂及佐剂功能:它能显著增强胰岛素对自身免疫疾病的治疗效果,本实验诱导免疫耐受的较佳组合为混合的100μg胰岛素和10μg CTB含量的蚕血;而且单独喂养CTB的NOD小鼠也显示出良好的免疫增强作用,能够延缓NOD小鼠的糖尿病发作,制止进～步的胰岛的恶化。2. 小麦小孢子特异表达β-expansin基因TaEXPB2的克隆与表达 Expansin是一种体外诱导分离的植物细胞壁伸展的蛋白,在修饰细胞壁基础上使细胞膨胀。Expansin的功能众多,除了细胞生长,还包括营养生长、形态发生、授粉受精、果实软化等,并表现出高度组织、器官和细胞特异性。 本论文在小麦小孢子特异表达阶段,经基因组DNA提取、RT-PCR、Northern及Southern技术,首次鉴定出了一个小麦小孢子特异β-expansin cDNA-TaEXPB2

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第一部分 文献综述和实验设计方案
  • 第一章 霍乱毒素B亚单位的研究进展
  • 1.1 霍乱弧菌（V.cholerae）和霍乱毒素
  • 1.1.1 霍乱弧菌
  • 1.1.2 霍乱毒素
  • 1.2 霍乱毒素B亚单位的基因表达
  • 1.3 霍乱毒素B亚单位的应用
  • 1.3.1 载体蛋白
  • 1.3.2 免疫佐剂
  • 1.3.3 口服及鼻内免疫蛋白
  • 1.3.4 CTB与免疫原的不同使用方法和免疫途径对其免疫作用的影响
  • 1.4 霍乱毒素B亚单位的研究进展
  • 1.4.1 融合表达研究
  • 1.4.2 口服免疫研究
  • 1.4.3 鼻内免疫研究
  • 第二章 Expansin—细胞壁松弛蛋白
  • 2.1 Expansin家族
  • 2.2 Expansin的功能
  • 2.2.1 植株营养生长
  • 2.2.2 根系生长
  • 2.2.3 种子发育和萌发
  • 2.2.4 果实成熟软化
  • 2.2.5 授粉受精
  • 2.2.6 其他功能
  • 2.3 其他生物类expansin研究
  • 2.4 Expansin的蛋白结构和作用机制
  • 2.5 研究展望
  • 第三章 杆状病毒表达载体系统
  • 3.1 杆状病毒的分类
  • 3.2 杆状病毒的生活史
  • 3.3 杆状病毒的基因及其功能
  • 3.3.1 编码多角体相关蛋白质的基因
  • 3.3.2 编码病毒体结构蛋白基因
  • 3.4 昆虫杆状病毒表达系统的基本原理
  • 3.5 杆状病毒载体表达系统的改进
  • 3.5.1 重组病毒筛选方法的改进
  • 3.5.2 提高病毒重组效率方面的改进
  • 3.5.3 杆状病毒表达载体的改进
  • 3.6 杆状病毒载体表达系统的特点
  • 3.6.1 杆状病毒表达系统的优点
  • 3.6.2 家蚕/BmNPV系统相对于sf细胞/AcNPV系统的优势
  • 3.6.3 杆状病毒表达系统存在的缺陷
  • 3.7 杆状病毒表达载体系统表达水平的影响因素
  • 3.7.1 细胞类型与质量
  • 3.7.2 外源蛋白的性质
  • 3.7.3 启动子序列的完整性与类型
  • 3.7.4 融合蛋白
  • 3.7.5 在昆虫细胞内表达与幼虫体内表达
  • 3.7.6 其它因素
  • 3.8 结语
  • 第四章 实验设计方案
  • 4.1 实验的目的和意义
  • 4.1.1 霍乱毒素B亚基在家蚕杆状病毒表达系统的表达与活性分析
  • 4.1.2 小麦小孢子特异表达β-expansin基因TaEXPB2的克隆与表达
  • 4.2 研究的主要内容
  • 4.2.1 霍乱毒素B亚基在家蚕杆状病毒表达系统的表达与活性分析
  • 4.2.2 小麦小孢子特异表达β-expansin基因TaEXPB2的克隆与表达
  • 4.3 实验流程图
  • 4.3.1 霍乱毒素B亚基在家蚕杆状病毒表达系统的表达与活性分析
  • 4.3.2 小麦小孢子特异表达β-expansin基因TaEXPB2的克隆与表达
  • 第二部分 霍乱毒素B亚基在家蚕杆状病毒表达系统的表达与活性分析
  • 第五章 家蚕杆状病毒重组转移载体的构建
  • 5.1 材料和试剂
  • 5.2 实验方法
  • 5.2.1 引物的设计和PCR
  • 5.2.2 低熔点胶回收目的片段
  • 5.2.3 质粒抽提：
  • 5.2.4 核酸电泳
  • 5.2.5 酶切反应
  • 5.2.6 连接反应
  • 5.2.7 E.coli TG1感受态细胞的制备
  • 5.2.8 连接产物转化感受态细胞
  • 5.2.9 重组转移载体的鉴定
  • 5.3 结果和分析
  • 5.3.1 序列测定
  • 5.3.2 重组转移载体pBacPAK8-mCTB的构建
  • 5.3.3 重组转移载体pBacPAK-mCTB的鉴定
  • 5.4 讨论
  • 第六章 重组家蚕杆状病毒的筛选和鉴定
  • 6.1 材料和试剂
  • 6.2 实验方法
  • 6.2.1 细胞培养、冻存与复苏
  • 6.2.2 病毒培养
  • 6.2.3 病毒滴度测定
  • 6.2.4 Bm-BacPAK6 DNA的提取及酶切线性化
  • 6.2.5 重组转移载体质粒与线性化病毒DNA共转染
  • 6.2.6 重组病毒的筛选
  • 6.2.7 重组病毒的DNA Southern杂交鉴定
  • 6.2.8 重组病毒的PCR鉴定
  • 6.3 结果与讨论
  • 6.3.1 共转染及重组病毒的筛选
  • 6.3.2 PCR鉴定
  • 6.3.3 Southern杂交鉴定
  • 6.3.4 重组病毒的滴度测定
  • 第七章 霍乱毒素B亚基在家蚕及小鼠中的表达及活性分析
  • 7.1 材料和试剂
  • 7.2 实验方法
  • 7.2.1 重组病毒在家蚕细胞和五龄幼虫中的表达
  • 7.2.2 SDS-PAGE电泳分析
  • 7.2.3 表达产物的ELISA检测
  • 7.2.4 表达产物的Western blotting分析
  • 7.2.5 动物免疫增强实验
  • 7.3 结果和分析
  • 7.3.1 表达产物的ELISA检测
  • 7.3.2 表达产物的GM1-ELISA活性检测
  • 7.3.3 表达产物的蛋白质电泳与Western blotting分析
  • 7.3.4 重组CTB蛋白对增强Ⅰ型糖尿病口服耐受分析
  • 7.4 讨论
  • 第三部分 小麦小孢子特异表达的β-expansin基因TaEXPB2的获得与鉴定
  • 第八章 小麦小孢子特异表达β-expansin基因TaEXPB2的获得与鉴定
  • 8.1 材料和试剂
  • 8.2 实验方法
  • 8.2.1 RNA和基因组DNA分离
  • 8.2.2 RT-PCR分析
  • 8.2.3 Northern blotting分析
  • 8.2.4 Southern blotting分析
  • 8.2.5 特异TaEXPB2基因克隆入载体pCR2.1
  • 8.2.6 测序
  • 8.2.7 同源性及蛋白预测分析
  • 8.3 结果和分析
  • 8.3.1 TaEXPB2基因序列
  • 8.3.2 RT-PCR分析
  • 8.3.3 TaEXPB2基因的体内表达模式分析
  • 8.3.4 Southern杂交分析
  • 8.4 讨论
  • 第九章 TaEXPB2基因的原核表达、纯化及检测
  • 9.1 材料和试剂
  • 9.2 实验方法
  • 9.2.1 引物的设计和PCR
  • 9.2.2 基因转入表达载体
  • 9.2.3 重组质粒的GST诱导表达及样品处理
  • 9.2.4 表达的重组蛋白的纯化
  • 9.2.5 兔源TaEXPB2抗体的制备
  • 9.2.6 兔源TaEXPB2多克隆抗体的ELISA检测效价
  • 9.2.7 表达的融合蛋白的Western blotting分析
  • 9.3 结果和分析
  • 9.3.1 重组质粒pGEX-TaEXPB2的构建策略
  • 9.3.2 重组质粒pGEX-TaEXPB2的鉴定
  • 9.3.3 表达的重组蛋白的蛋白质电泳及纯化
  • 9.3.4 TaEXPB2特异多肽的设计和合成及多克隆抗体的制备
  • 9.3.5 重组蛋白的Western杂交分析
  • 第十章 TaEXPB2基因在家蚕杆状病毒载体系统中的表达与鉴定
  • 10.1 材料和试剂
  • 10.2 实验方法
  • 10.2.1 引物的设计和PCR
  • 10.2.2 外源基因在家蚕杆状病毒载体系统中的表达
  • 10.3 结果和分析
  • 10.3.1 TaEXPB2基因的序列测定
  • 10.3.2 重组转移载体pBacPAK8-TaEXPB2的构建策略
  • 10.3.3 重组转移载体pBacPAK-TaEXPB2的鉴定
  • 10.3.4 共转染及重组病毒的筛选
  • 10.3.5 重组病毒的PCR鉴定
  • 10.3.6 重组病毒的滴度测定
  • 10.3.7 重组病毒的其他鉴定
  • 10.4 讨论
  • 总结
  • 参考文献
  • 致谢

    • 相关论文文献

    • [1].霍乱毒素B亚单位对树突状细胞成熟的影响[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2010(44)
    • [2].不含佛波酯和霍乱毒素条件下体外培养小儿正常表皮黑素细胞的实验研究[J]. 中山大学学报(医学科学版) 2011(03)
    • [3].霍乱毒素B亚单位-神经生长因子耦联制剂滴鼻对拟痴呆小鼠空间学习记忆的影响[J]. 中国康复理论与实践 2010(04)
    • [4].霍乱毒素B亚单位对大鼠结肠炎组织MPO、IL-10水平的影响[J]. 中国热带医学 2008(06)
    • [5].变形链球菌乳酸脱氢酶与霍乱毒素B亚单位嵌合基因植物表达质粒的构建及转化烟草研究[J]. 滨州医学院学报 2011(06)
    • [6].大鼠“承山”穴的神经解剖学特征——霍乱毒素亚单位B结合荧光素488法[J]. 针刺研究 2010(06)
    • [7].霍乱毒素对垂体腺瘤的诱导分化潜能及机制的研究进展[J]. 中山大学学报(医学科学版) 2008(S2)
    • [8].霍乱毒素B亚单位对小鼠免疫细胞及细胞因子的影响[J]. 安徽医科大学学报 2019(04)
    • [9].大鼠“涌泉”穴区相关神经元及其纤维投射的节段和区域性分布——霍乱毒素亚单位B法[J]. 针刺研究 2013(05)
    • [10].霍乱毒素及相关无毒助剂mmCT和dmLT,通过环腺苷酸蛋白激酶A和炎性体依赖白介素-1信号促进Th-17细胞应答[J]. 微生物学免疫学进展 2016(02)
    • [11].佐剂在肺炎链球菌疫苗免疫中的作用[J]. 重庆医学 2016(25)
    • [12].变异链球菌乳酸脱氢酶与霍乱毒素B亚单位嵌合表达质粒的构建和表达[J]. 牙体牙髓牙周病学杂志 2012(07)
    • [13].霍乱毒素B亚单位与胰岛素B链结构类似多肽融合蛋白的制备[J]. 药物生物技术 2012(02)
    • [14].日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶抗原表位与霍乱毒素B亚基融合蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞的表达[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2019(03)
    • [15].利用霍乱毒素B亚单位展示猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白主要抗原表位[J]. 江苏农业学报 2016(03)
    • [16].霍乱毒素B亚单位植物细胞表达载体的构建及其在人参细胞中的表达[J]. 中国生物制品学杂志 2009(07)
    • [17].霍乱毒素B亚单位在疫苗研究中的应用[J]. 生物技术通报 2008(05)
    • [18].以霍乱毒素B亚单位为载体的甲型副伤寒多糖结合疫苗理化及生物学特性[J]. 中国生物制品学杂志 2019(08)
    • [19].幽门螺旋杆菌尿素酶A亚基抗原表位肽与霍乱毒素B亚基融合蛋白的生物信息学设计及表达优化研究(英文)[J]. 生物技术进展 2013(01)
    • [20].霍乱毒素作为黏膜佐剂的研究进展[J]. 中国病原生物学杂志 2012(01)
    • [21].不相容双质粒共表达霍乱毒素类似嵌合蛋白[J]. 基因组学与应用生物学 2015(07)
    • [22].新产品新技术[J]. 中国中小企业 2011(04)
    • [23].霍乱毒素检测方法的研究[J]. 疾病监测 2008(07)
    • [24].黏膜免疫佐剂的筛选Ⅱ.ELISA检测[J]. 湖北畜牧兽医 2015(11)
    • [25].变异链球菌表面蛋白PAcP与霍乱毒素B亚单位融合基因在转基因番茄中的表达[J]. 上海口腔医学 2014(03)
    • [26].抗β淀粉样蛋白单克隆抗体绕过血脑屏障进入小鼠大脑海马区有效途径的研究[J]. 中华老年心脑血管病杂志 2012(09)
    • [27].具有生物活性的多价糖肽的研究进展[J]. 药学研究 2017(08)
    • [28].变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因转基因黄瓜植株的获得及鉴定[J]. 口腔医学研究 2016(09)
    • [29].霍乱毒素A亚单位基因的原核表达及单克隆抗体的制备[J]. 中国生物制品学杂志 2014(06)
    • [30].鼠表皮干细胞的稳定分选方法及其体外培养体系建立[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2008(25)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  

    霍乱毒素B亚基和小麦小孢子特异表达β-expansin基因的表达研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5