论文摘要
目的研究滚压载荷生物力学反应器用于培养软骨组织效果及Ⅱ型胶原对去分化软骨的再分化作用。方法1自新西兰大白兔双膝关节提取软骨细胞,经体外培养瓶培养后,与琼脂糖支架复合,应用滚压载荷生物力学反应器周期性施加力学刺激,设置参数为压缩形变量0.2,滚压频率1hz,滚压时间0.5h/D。与滚压day 7、14d行死活细胞染色、Alcian Blue （AB）染色及GAG含量检测,并于滚压后14d取出样本进行Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖mRNA表达的检测。2无菌条件下取7月龄新西兰大耳白兔双侧膝关节分离培养软骨细胞,体外单层传代培养至第7代,分别为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7。采用RT-PCR、实时定量PCR、1,9二甲基亚甲蓝（1, 9-dimethylmethylene blue,DMMB）法检测其表型维持情况。根据观察结果,选择去分化的软骨细胞（P7）,并给予不同浓度（0.5%、1.0%、1.5%）Ⅱ型胶原蛋白刺激。采用RT-PCR及实时定量PCR检测各浓度组去分化软骨细胞再分化的程度,DMMB法检测糖胺聚糖分泌情况。结果1滚压载荷生物力学反应器培养软骨组织研究结果:滚压载荷后day 7、14d,AB染色后可见对照组day 7标本未见明显蓝染团块,14d可见小面积蓝染团块。实验组day 7可见切片部分区域少量蛋白聚糖分泌,14d大量蛋白聚糖分泌,使切片呈现团块状蓝染。day 7、14d实验组GAG含量分别与对照组比较差异显著（P<0.05）。于14d取实验组及对照组标本作Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖mRNA的realtime RNA相对定量检测。实验组I型胶原mRNA表达量明显低于对照组（P<0.05）。实验组Ⅱ型胶原mRNA相对含量明显高于对照组（P<0.05）。实验组糖胺聚糖mRNA相对含量明显高于对照组（P<0.05）。2Ⅱ型胶原对去分化软骨的再分化作用研究结果:P1～P7细胞糖胺聚糖含量分别为（12.20±0.17）、（11.20±0.24）、（11.18±0.16）、（10.89±0.50）、（8.73±0.19）、（9.39±0.32）、（8.18±0.20）μg,P2、P3、P4间细胞糖胺聚糖含量比较,差异均无统计学意义（P>0.05）;其余各代次细胞糖胺聚糖含量比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。P4、P5、P6、P7Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖mRNA均有表达,其中P4～P7间Ⅰ型胶原mRNA表达比较,差异无统计学意义（P>0.05）;Ⅱ型胶原及蛋白聚糖比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。0.5%、1.0%、1.5%浓度组的P7软骨细胞糖胺聚糖含量分别为（8.20±0.16）、（14.61±0.33）、（13.93±0.25）、（19.59±0.46）μg,组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。随着Ⅱ型胶原蛋白浓度的升高,各浓度组细胞Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达逐渐增强,Ⅰ型胶原表达减弱;不同浓度组中Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖mRNA表达比较,差异均有统计学意义（P <0.05）。结论:1滚压载荷生物反应器可以有效提高软骨细胞Ⅱ型胶原及蛋白聚糖基因表达及蛋白合成,降低I型胶原蛋白合成,维持软骨细胞表型稳定。2Ⅱ型胶原蛋白可促进兔去分化软骨细胞再分化与活化。