Anabaena PCC 7120中异形胞的发育与DNA复制协调关系的机制研究

论文摘要

蛋白内含子(内含肽，intein)广泛分布于多种多样的生物体中，包括真细菌，古细菌和真核生物。在蓝细菌中存在着许多的蛋白内含子(内含肽)，其中，许多已经在体外对其进行了生物化学的研究。但是，没有证据表明在蓝细菌细胞体内蛋白内含子(内含肽)的切除。在丝状体的鱼腥蓝细菌菌株Anabaena sp．strain PCC 7120中，DNA聚合酶Ⅲ中的α亚基，复制因子DnaE，由两个分离的开放阅读框架(ORF)所编码，这两个开放阅读框架分别位于Anabaena PCC 7120染色体上的两条链上，并且彼此相距约3.1 M bp，每个开放阅读框架中包含了一个蛋白内含子(内含肽)。该生物能进行细胞发育过程形成能进行固氮作用的细胞，即异形胞。异形胞是一种末端分化的细胞，在异形胞中细胞周期被终止。DNA复制过程是细胞周期过程中的关键步骤。既然DnaE是DNA复制过程中非常关键的成分，它也可以说是细胞周期中的关键蛋白，因此，我们希望能在蓝细菌中找到蛋白内含子(内含肽)能够在细胞内发生剪接的实验证据，并且确定成熟的DnaE蛋白是否在异形胞中依然存在。在本研究中，我们证实了由两个开放阅读框架(ORF)编码DnaE蛋白可以通过蛋白质反式剪接作用连接起来形成完整的DnaE蛋白。更有趣的是，我们第一次在蓝细菌体内检测到了蛋白质的反式剪接，这个发现使我们可以将异形胞和营养细胞中成熟DnaE蛋白的形成进行比较，结果显示，成熟的DnaE蛋白可以在两种细胞类型中形成。通过将两个分离的基因的启动子序列与gfp报告基因构建转录水平上的融合克隆，也证实了两个基因在营养细胞和异形胞中都进行了转录，并且发现在异形胞的分化过程中，转录水平没有很大的变化。尽管异形胞是末端分化的细胞，不能进行染色体的复制，但是DnaE在异形胞中的表达和成熟可能在DNA复制之外过程中担负一定的功能，如DNA的重组和修复。 DnaA是DNA复制起始蛋白，它在细胞周期中担负着必需的功能。因此我们也有兴趣对其在不同的细胞类型中的表达进行检测。实验结果显示DnaA的表达在细胞的发育过程中具有波动性，这可能意味着DnaA可能还有其它的功能，或在前异形胞还有表达。DnaA的温度敏感型突变体已经在大肠杆菌和链霉菌中获得，它有利于获得同步生长的培养物。本研究也尝试通过定点突变在Anabaena PCC 7120中筛选温度敏感型菌株，以便于考察细胞周期和异形胞分化之间的关系。温度敏感型突变体也是研究基因功能的好材料。初步筛选显示一些单交换的菌株出现对39℃温度敏感。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1.前言—文献综述
• 1.1 蛋白内含子（内含肽）的研究进展
• 1.1.1 蛋白内含子（内含肽）简介
• 1.1.1.1 什么是蛋白内含子（内含肽）
• 1.1.1.2 蛋白内含子（内含肽）的发现
• 1.1.1.3 Intein和Extein名词的来历
• 1.1.1.4 蛋白内含子（内含肽）剪接和RNA剪接的对比
• 1.1.2 蛋白内含子（内含肽）的分布,类型和结构
• 1.1.2.1 蛋白内含子（内含肽）的分布
• 1.1.2.2 蛋白内含子（内含肽）的类型
• 1.1.2.3 蛋白内含子（内含肽）的结构
• 1.1.2.4 分离的蛋白内含子（内含肽）
• 1.1.2.5 三维结构比较
• 1.1.2.6 如何识别新的内含肽
• 1.1.3 蛋白内含子（内含肽）的剪接机制
• 1.1.3.1 体外实验体系促进分支蛋白质中间产物的发现
• 1.1.3.2 蛋白内含子（内含肽）剪接机制
• 1.1.4 蛋白内含子（内含肽）的自导和水平转移
• 1.1.4.1 自导作用
• 1.1.4.2 自导作用中的有性结合和水平转移
• 1.1.5 蛋白内含子（内含肽）的起源和宿主偏爱
• 1.1.5.1 蛋白内含子（内含肽）的起源
• 1.1.5.2 蛋白内含子（内含肽）的宿主偏爱
• 1.1.6 蛋白内含子（内含肽）在生物技术上的应用
• 1.1.6.1 蛋白质的纯化
• 1.1.6.2 毒素蛋白的合成
• 1.1.6.3 结构分析
• 1.1.6.4 药物学应用
• 1.1.6.5 蛋白质相互作用和活性位点剖析的研究
• 1.1.6.6 转基因植物上的应用
• 1.1.7 小结
• 1.2 蓝细菌异形胞的发育机制
• 1.2.1 蓝细菌背景介绍
• 1.2.2 蓝细菌异形胞的特征
• 1.2.2.1 异形胞的形态特征
• 1.2.2.2 异形胞的功能特征
• 1.2.2.3 蓝细菌氮源利用调节
• 1.2.3 异形胞的的发育机制
• 1.2.3.1 异形胞发育的调控
• 1.2.3.2 异形胞空间分布模式的调控
• 1.2.3 3 调控异形胞包被形成的基因
• 1.2.3.4 异形胞特异性染色体重排
• 1.2.3.5 异形胞代谢的调控
• 1.3 细胞分裂和分化
• 1.3.1 Escherichia.coli染色体复制
• 1.3.2 Caulobacter crescentus的发育
• 1.3.3 Bacillus subtilis的芽孢分化
• 1.4 研究目的和意义
• 2.材料和方法
• 2.1 菌株与质粒
• 2.2 培养基配方以及培养条件
• 2.3 常用贮存液和缓冲液配方
• 2.3.1 贮存液
• 2.3.2 缓冲液
• 2.3.2.1 常用缓冲溶液
• 2.3.2.2 质粒DNA小量制备的碱裂解缓冲液
• 2.4 主要的分子生物学试剂
• 2.5 实验方法
• 2.5.1 Anabaena PCC 7120基因组中DNA聚合酶基因的查找与分析
• 2.5.1.1 Anabaena PCC 7120中的DNA聚合酶查找
• 2.5.2 Anabaena PCC 7120总DNA的抽提
• 2.5.2.1 大量抽提总DNA
• 2.5.2.2 小量抽提总DNA
• 2.5.3 Anabaena PCC 7120异形胞的诱导和分离
• 2.5.3.1 异形胞的常规分离
• 2.5.3.2 异形胞的快速分离
• 2.5.4 质粒DNA的制备及其基本操作
• 2.5.4.1 大肠杆菌质粒DNA的大量（少量）提取
• 2.5.4.2 质粒DNA的操作
• 2.5.4.3 质粒DNA去磷酸化
• 2.5.5 转化
• 2.5.5.1 大肠杆菌的常规转化
• 2.5.5.2 大肠杆菌表达宿主细胞的转化
• 2.5.5.3 Anabaena PCC 7120通过三亲本杂交进行基因转移
• 2.5.6 PCR介导的dnaA基因的体外定点突变
• 2.5.7 dnaENI和dnaECI的启动子与报告基因gfp融合载体的构建
• 2.5.8 重组融合表达质粒的构建
• 2.5.9 蛋白质的表达和纯化
• 2.5.9.1 蛋白质的诱导表达
• 2.5.9.2 蛋白质表达产物的小量制备
• 2.5.9.3 蛋白质表达产物的大量制备
• 2.5.9.4 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.5.9.5 蛋白质的纯化
• 2.5.10 抗血清的制备和纯化
• 2.5.10.1 家兔的免疫
• 2.5.10.2 抗血清的收集和保存
• 2.5.10.3 抗体的纯化
• 2.5.11 Anabaena PCC 7120中蛋白质的制备和定量
• 2.5.11.1 营养细胞中蛋白质的提取
• 2.5.11.2 异形胞及两种类型混合的细胞的蛋白质提取
• 2.5.11.3 蛋白质定量
• 2.5.12 Western Blotting
• 2.5.12.1 蛋白质印迹：从SDS—PAGE向硝酸纤维素膜上进行半干式转移
• 2.5.12.2 免疫杂交
• 2.5.12.3 PVDF印迹
• 3.结果与分析
• 3.1 Anabaena PCC 7120中DNA复制蛋白质或酶的生物信息学分析
• 3.1.1 DNA复制过程中涉及到的蛋白质或酶的比较分析
• 3.1.2 蛋白内含子（内含肽）在Anabaena PCC 7120染色体上的分布
• 3.1.3 Anabaena PCC 7120和Synechocystis PCC 6803的DnaE／dnaE之间的比较
• 3.2 重组蛋白的表达
• 3.2.1 DnaA蛋白质的表达
• 3.2.2 不同的DnaE多肽的表达
• 3.2.2.1 DnaENI'和DnaECI'重组融合表达质粒的构建
• 3.2.2.2 DnaENI'和DnaECI'双重组融合表达质粒的构建
• 3.2.2.3 成熟的DnaE重组表达质粒的构建
• 3.2.2.4 不同的DnaE多肽的表达
• 3.3 抗血清的制备和纯化
• 3.4 Anabaena PCC 7120中DnaE蛋白内含子的体外反式剪接
• 3.4.1 DnaE蛋白内含子的体外反式剪接
• 3.4.2 DnaE蛋白内含子在大肠杆菌体内的反式剪接
• 3.5 Anabaena PCC 7120中DnaE蛋白内含子的体内反式剪接
• 3.5.1 DnaE蛋白内含子的体内反式剪接
• 3.5.2 DnaE蛋白内含子在两种不同类型细胞内的反式剪接
• 3.5.3 DnaE蛋白在Anabaena PCC 7120细胞中的存在形式
• 3.5.3.1 DnaE蛋白在Anabaena PCC 7120营养细胞中的存在形式
• 3.5.3.2 DnaENI蛋白在Anabaena PCC 7120两种类型细胞中的存在
• 3.6 dnaENI和dnaECI在Anabaena PCC 7120中的转录分析
• 3.6.1 dnaENI和dnaECI在营养细胞内的转录分析
• 3.6.2 dnaENI和dnaECl在异形胞中的转录分析
• 3.7 Anabaena PCC 7120中DnaA蛋白在异形胞中的表达
• 3.8 Anabaena PCC 7120温度敏感型的筛选
• 3.8.1 Anabaena PCC 7120与E. coli的DnaA蛋白质序列比较
• 3.8.2 引物的设计
• 3.8.3 高保真PCR
• 3.8.4 突变的dnaA基因克隆到pBluescript SK上
• 3.8.5 突变的dnaA基因插入到整合质粒pRL271中
• 3.8.6 温度敏感型突变株的筛选
• 4.讨论
• 参考文献
• 致谢