以procaspase-3为靶点的体外比色法高通量筛选平台的建立

论文摘要

研究表明Caspase（半胱天冬蛋白酶）家族蛋白在肿瘤细胞凋亡过程中起关键作用。作为效应蛋白,其功能执行需要激活酶原procaspase-3成为有活性的caspase-3。临床研究发现,procaspase-3水平在多种恶性肿瘤细胞中升高,提示其与肿瘤分类、诊断具有内在联系。最近研究发现的小分子化合物PAC-1,具有对procaspase-3直接、高效的活化作用,且对多种肿瘤细胞有显著的抑制活性,裸鼠实验发现,PAC-1可显著性缩小或消除软组织肉瘤、皮肤黑色素瘤和肺癌病灶组织,对正常组织无损伤。提示procaspase-3可能是肿瘤药物作用的新靶点。因此,构建以procaspase-3为靶点的体内外高通量筛选平台将有助于PAC-1类化合物的筛选与构效关系研究,有利于阐明药物作用机制,推进此类化合物的应用开发。本论文基于上述研究背景建立以procaspase-3为活化靶点的高通量比色法体外筛选平台,并进行初步验证,筛选类似PAC-1的procaspase-3激活剂。本研究首先在大肠杆菌中进行procaspase-3蛋白的制备。构建质粒pET-21b-Tag（His）-CPP32,此质粒可表达带组氨酸标签（His-Tag）的人源重组（rch）procaspase-3蛋白。以IPTG诱导pET-21b-Tag（His）-CPP32在大肠杆菌中可溶性表达,采用镍离子螯合层析方法进行分离纯化,通过超滤、真空冻干进一步纯化、浓缩,得到目的蛋白达电泳纯,以Band Scan软件分析,达SDS-PAGE级纯度约80%,每升发酵菌液可制备约6mg蛋白。然后,以所制备的procaspase-3蛋白为工具,建立筛选平台。通过对筛选条件,如激活剂孵育时间、缓冲液的配制、底物浓度选择等的优化,建立了在96孔板上操作,以酶标仪进行检测的高通量比色法。在纯体外蛋白酶水平与HL-60细胞抽提物水平均可进行caspase-3酶活力检测。体外蛋白酶水平,得到PAC-1活化后高酶活力的caspase-3（酶活力4690.52 pmol／min）,活化组与对照组相比caspase-3活性升高约2倍,差异具有统计学意义（1.5409±0.01634 VS0.5439±0.11531,P<0.01）；HL-60细胞提取caspase-3水平,酶活力为595.62pmol／min,PAC-1诱导凋亡组与对照组相比,Caspase-3活性升高约1倍,差异具有统计学意义（0.5164±0.0713 VS 0.2549±0.2549,P<0.01）。考查高通量方法评价因子——Z’因子,达0.5以上（在上述两水平分别达0.728,0.573）。该方法稳定、可靠,符合高通量筛选需求。最后,对筛选平台进行初步验证与应用。筛选20种PAC-1衍生物,得到一种有潜在开发价值的化合物。结合Western Blotting（免疫印迹）检测,MTT法进行HL-60细胞水平筛选,辅助确认了该化合物的作用靶点及所建立方法的可靠性。综上所述,本研究建立了以procaspase-3为活化靶点的体外高通量比色法筛选平台,可用于procaspas-3激活剂的筛选。同时建立了在大肠杆菌中制备、纯化procaspase-3蛋白的方法,为进一步研究奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 绪论
• 第一章 Procaspase-3蛋白在大肠杆菌中的诱导表达与分离纯化
• 前言
• 第一节 实验材料与方法
• 1 实验材料与仪器
• 2 实验方法
• （His）-CPP32的优化构建'>2.1 表达质粒pET-21b-Tag_（His）-CPP32的优化构建
• 2.1.1 双酶切获得目的基因CPP32片段
• 2.1.2 表达载体pET-21b（+）的制备
• 2.1.3 表达载体pET-21b（+）的双酶切
• 2.1.4 连接
• 2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.1 用氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞
• 2.2.2 热转化大肠杆菌感受态细胞
• 2.2.3 含重组质粒的细菌菌落的鉴定
• 2.3 重组pET-21b-Tag（His）-CPP32的表达验证及可溶性分析
• 2.3.1 表达及可溶性分析
• 2.3.2 SDS-PAGE电泳
• 2.4 目的蛋白的诱导表达与分离纯化
• 2.4.1 目的蛋白的实验室规模发酵制备
• 2.4.2 Ni-NTA Sepharose Fast Flow柱层析
• 2.4.3 过柱洗脱液的超滤与冻干
• 第二节 实验结果
• （His）-CPP32构建'>1 表达质粒pET-21b-Tag_（His）-CPP32构建
• （His）-CPP32构建流程设计'>1.1 表达质粒pET-21b-Tag_（His）-CPP32构建流程设计
• 1.2 提取质粒后对阳性重组子的验证
• 1.3 菌落菌种保藏后,以T7 promoter为引物测序
• 2 对阳性克隆重组子的诱导表达验证及可溶性分析
• 3 Ni-NTA Sepharose Fast Flow柱层析及电泳分析结果
• 第三节 讨论
• 小结
• 第二章 建立高通量体外比色法筛选平台
• 前言
• 第一节 实验材料与方法
• 1 实验材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 蛋白质含量测定—Lowry法
• 2.2 配制各缓冲液
• 2.3 准备各试剂贮存液
• 2.4 备样
• 2.5 分组与加样
• 2.6 检测
• 2.7 数据分析
• 2.8 HL-60细胞提取蛋白的比色法检测
• 第二节 实验结果
• 1 蛋白质含量测定
• 2 比色法基本组OD值-T曲线与方法评价（Z’因子考察）及组间差异统计
• 3 求caspase-3酶活力
• 4 细胞内提取caspase-3蛋白的活性检测
• 5 不同浓度PAC-1对rch-procaspase-3的体外活化作用
• 6 底物的灵敏、有效性
• 第三节 讨论
• 小结
• 第三章 高通量比色法的初步应用及Western Blotting检测辅助验证靶点等
• 前言
• 第一节 实验材料与方法
• 1 实验材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 Western blot analysis（免疫印迹法）
• 2.1.1 工作液的配制
• 2.1.2 蛋白质电泳
• 2.1.3 免疫印迹
• 2.2 20种PAC-1衍生物的溶解
• 2.3 给药处理HL-60细胞
• 2.4 MTT法检测
• 2.4.1 MTT法的基本原理
• 2.4.2 MTT法的测定方法
• 2.5 统计方法
• 第二节 实验结果
• 1 比色法对20种化合物的筛选结果与分析
• 2 Western Blotting法对化合物WF-210对procaspase-3活化作用的确认
• 3 HL-60水平对20种PAC-1衍生物的筛选与分析
• 第三节 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢