海参肠道β-1，3-葡聚糖酶的提取、纯化及其特性的研究

论文摘要

水生动物消化、利用所摄取营养物质的能力取决于存在于其肠道内的消化酶类。海参营养丰富,还含有很多生物活性物质,是一种非常重要的经济水产动物。对海参肠道消化酶的研究对了解海参消化、促进海参养殖提供了科学的依据。p-葡聚糖酶是最重要的消化酶之一。本文通过对海参肠道p-1,3-葡聚糖酶的提取、纯化及酶学性质的研究,优化了海参肠道p-1,3-葡聚糖酶的最佳提取条件；建立了包括阴离子交换层析、疏水层析、PAGE-凝胶电泳在内的酶分离纯化方法；研究了提纯酶的分子量及酶学性质。实验结果表明,海参肠道p-1,3-葡聚糖酶的最佳提取条件为：含0.05mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液（pH6.0）；缓冲液：海参肠（v／w）=4：1；盐析时硫酸铵饱和度为80%。经DEAE-Sepharose CL-6B、Butyl-Sepharose4Fast Flow和Native-PAGE电泳后,提纯酶酶活力相对于粗酶纯化了23.24倍,经SDS-PAGE测定分子量约为37.5kDa。该酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH值为5.0,在不高于40℃,pH5.0-8.0范围内稳定性较好。Mn2+对酶具有一定的激活作用,Cu2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Ba2+、 K+、Ag+对酶有不同程度的抑制,其中Cu2+对酶的抑制作用最强,Ag+的抑制作用次之。β-1,3-葡聚糖酶水解昆布多糖的米氏常数Km为19.8ug/mL, Vmax为2000ug/min·mg。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 海参
• 1.1.1 海参介绍
• 1.1.2 海参成分
• 1.2 水产动物消化酶
• 1.2.1 消化酶研究与海参养殖之间的关系
• 1.2.2 海参消化酶的研究现状
• 1.3 β-葡聚糖酶
• 1.3.1 β-葡聚糖酶的来源
• 1.3.1.1 植物来源的β-葡聚糖酶
• 1.3.1.2 微生物来源的β-葡聚糖酶
• 1.3.1.3 动植物来源的β-葡聚糖酶
• 1.3.2 β-葡聚糖酶的分类及作用方式
• 1.3.3 β-葡聚糖酶的应用
• 1.3.3.1 在食品工业上的应用
• 1.3.3.2 在饲料工业中的应用
• 1.3.3.3 在基因工程中的应用
• 1.4 β-1,3-葡聚糖酶
• 1.4.1 β-1,3-葡聚糖酶的分布
• 1.4.2 β-1,3-葡聚糖酶的研究现状
• 1.4.2.1 β-1,3-葡聚糖酶可诱导性的研究
• 1.4.2.2 β-1,3-葡聚糖酶基因表达调控的研究
• 1.4.2.3 β-1,3-葡聚糖酶基因工程方面的研究
• 1.4.2.4 β-1,3-葡聚糖酶的纯化
• 1.5 本课题的主要研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验原料
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 主要实验试剂
• 2.2 主要试剂的配制
• 2.2.1 Folin-酚甲液的配制
• 2.2.2 Folin-酚乙液的配制
• 2.2.3 蛋白质凝胶电泳试剂的配制
• 2.2.4 考马斯亮兰染色所需试剂
• 2.2.5 活性染色所需试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 β-1,3-葡聚糖酶酶活的测定
• 2.3.2 蛋白质含量的测定
• 2.3.3 非变性凝胶电泳
• 2.3.4 活性染色
• 2.3.5 SDS-PAGE电泳
• 2.4 β-1,3-葡聚糖酶提取条件的单因素试验
• 2.4.1 最佳提取缓冲液pH值的确定
• 2.4.2 最佳提取缓冲液离子强度的确定
• 2.4.3 最佳提取缓冲液体积的确定
• 2.4.4 最佳浸提时间确定
• 2.4.5 β-1,3-葡聚糖酶提取条件的正交试验
• 2.5 β-1,3-葡聚糖酶沉淀方法的确定
• 2.5.1 盐析沉淀法
• 2.5.2 乙醇沉淀法
• 2.5.3 丙酮沉淀法
• 2.6 透析
• 2.6.1 透析袋的预处理
• 2.6.2 透析法除硫酸铵
• 2.7 β-1,3-葡聚糖酶沉淀方法的确定
• 2.7.1 DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析
• 2.7.2 Butyl-Sepharose 4 Fast Flow疏水层析
• 2.7.3 Native-PAGE分离
• 2.8 β-1,3-葡聚糖酶酶学性质的研究
• 2.8.1 酶纯度鉴定及分子量测定”
• 2.8.2 β-1,3-葡聚糖酶酸碱稳定性”
• 2.8.3 β-1,3-葡聚糖酶最适反应pH值的确定
• 2.8.4 β-1,3-葡聚糖酶最适反应温度的确定
• 2.8.5 β-1,3-葡聚糖酶的热稳定性
• 2.8.6 金属离子对β-1,3-葡聚糖酶活力的影响
• 2.8.7 β-1,3-葡聚糖酶的反应动力学
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 标准曲线的绘制
• 3.1.1 葡萄糖标准曲线的绘制
• 3.1.2 Folin-酚标准曲线的绘制
• 3.2 海参肠道β-1,3-葡聚糖酶提取条件的研究
• 3.2.1 缓冲液pH值对提取效果的影响
• 3.2.2 NaCl浓度对提取效果的影响
• 3.2.3 浸提体积对提取效果的影响
• 3.2.4 浸提时间对提取效果的影响
• 3.2.5 海参肠道β-1,3-葡聚糖酶的最佳提取工艺条件
• 3.3 β-1,3-葡聚糖酶的沉淀分离
• 3.3.1 硫酸铵饱和度对分离效果的影响
• 3.3.2 乙醇浓度对分离效果的影响
• 3.3.3 丙酮浓度对分离效果的影响
• 3.3.4 三种方法沉淀分离β-1,3-葡聚糖酶效果的比较
• 3.4 酶的纯化及鉴定
• 3.4.1 DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换层析”
• 3.4.2 Butyl-Sepharose 4 Fast Flow层析
• 3.4.3 Native-PAGE电泳
• 3.5 酶学性质的研究
• 3.5.1 酶的分子量
• 3.5.2 最适反应pH
• 3.5.3 最适反应温度
• 3.5.4 pH稳定性
• 3.5.5 热稳定性
• 3.5.6 金属离子对酶活力的影响
• 3.5.7 动力学的研究
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录