RNA干扰survivin基因表达增强HeLa细胞电离辐射敏感性的实验研究

论文摘要

survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins,IAP）家族的新成员,特异性表达于人的胚胎组织以及多数人类肿瘤细胞。在几乎所有常见肿瘤中,survivin都有表达。Survivin具有抑制凋亡、参与细胞周期调控、促进血管生成等生物学作用,与肿瘤细胞对辐射及化疗药物的耐受性增强有关,是肿瘤靶向治疗的重要基因之一。本研究旨在探讨survivin蛋白在X射线诱导HeLa细胞凋亡及染色体不稳定性（CIN）过程中所发挥的生物学作用。采用流式细胞术（FCM）检测X射线照射HeLa细胞后survivin蛋白表达、细胞凋亡和CIN的变化规律。结果显示,survivin在HeLa细胞中表达异常高,并且具有较高的转录水平;单纯X射线照射不能诱导HeLa细胞发生凋亡;受照细胞中发生CIN的细胞数随受照剂量的增高而显著增加,并且在接受4.0Gy照射后随着培养时间延长,发生CIN的细胞也随之增加。由于survivin具有组织表达选择性,使它成为RNAi技术应用的理想靶向基因。根据RNAi原理,利用pENTR-basic载体能够转录产生小的发卡状siRNA的特点,本研究成功构建了以survivin基因为靶点的pENTR-anti-SVV载体,在mRNA水平干扰survivin蛋白表达,以期对survivin蛋白在X射线诱导HeLa细胞凋亡及X射线诱导CIN过程中所产生的生物学影响进行研究。结果表明,干扰survivin蛋白表达后,电离辐射可以显著诱导细胞凋亡的产生,同时,发生CIN的细胞数也比单纯照射组显著增多。以上结果说明干扰survivin蛋白表达与辐射相结合可以加强辐射诱导的细胞凋亡及CIN的发生,本研究将为增强肿瘤辐射敏感性、提高放射治疗疗效提供理论依据。

论文目录

• 内容提要
• 英文缩写
• 第一章 绪论
• 第一部分 凋亡抑制蛋白——SURVIVIN
• 1. SURVIVIN 的理化性质
• 1.1 survivin 基因的分子结构
• 1.2 survivin 蛋白的分子结构
• 1.3 survivin 的异构体
• 1.4 survivin 的组织学分布
• 1.5 survivin 的周期性表达
• 1.6 survivin 的表达调控
• 1.7 survivin 与P53、Bcl-2 的关系
• 2. SURVIVIN 的作用机制
• 2.1 survivin 与细胞凋亡的关系
• 2.2 survivin 与细胞周期的关系
• 3. SURVIVIN 与肿瘤
• 3.1 survivin 与肿瘤发生、发展的关系
• 3.2 survivin 与肿瘤耐药性的关系
• 3.3 SURVIVIN 与肿瘤预后的关系
• 3.4 survivin 的靶向治疗方案
• 4. 研究展望
• 第二部分 RNAI 技术及其应用
• 1. RNAI 的作用机制
• 2. RNAI 的分子生物学特性
• 3. 产生RNAI 的方法
• 4. siRNA 结构对RNAI 的影响
• 5. 影响SIRNA 作用的因素
• 6. RNAI 的应用
• 6.1 在功能基因学中的应用
• 6.2 在抗病毒感染中的应用
• 6.3 在放射医学领域的应用
• 7. 问题与展望
• 第二章 材料与方法
• 1. 主要试剂及器材
• 1.1 试剂
• 1.2 器材
• 2. 主要仪器
• 3. 细胞株
• 4. 细胞生物学实验方法
• 4.1 培养液配制
• 4.2 小牛血清制备
• 4.3 胰酶配制
• 4.4 细胞培养
• 4.5 细胞冻存
• 4.6 细胞转染
• 4.7 照射条件
• 4.8 FCM 检测细胞蛋白表达
• 4.9 FCM 检测细胞周期
• 4.10 FCM 检测细胞凋亡
• 4.11 FCM 检测细胞染色体数目
• 4.12 免疫细胞化学方法
• 5. 细菌培养技术
• 5.1 菌种
• 5.2 细菌LB 培养基的配制
• 5.3 细菌复苏
• 5.4 细菌培养
• 5.5 细菌冻存
• 5.6 感受态菌的制备
• 5.7 细菌转化
• 5.8 质粒提取
• 5.9 质粒纯化法
• 6. 分子生物学实验方法
• 6.1 载体的构建
• 6.2 含pENTR-anti-survivin 的阳性克隆鉴定
• 6.3 RT-PCR
• 7. 统计学方法
• 第三章 实验结果
• 1. 不同组织来源的细胞中SURVIVIN 蛋白的表达
• 2. X射线对SURVIVIN 基因表达的影响及其生物学效应
• 2.1 X 射线对survivin 蛋白表达水平的影响
• 2.2 X 射线对survivin 基因转录水平的影响
• 2.3 X 射线对细胞凋亡的影响
• 2.4 X 射线对细胞周期的影响
• 2.5 X 射线对细胞染色体数目的影响
• 3 SHRNA 对X 射线诱导SURVIVIN 表达的影响及其生物学效应
• 3.1 重组干扰载体pENTR-anti-SVV 的构建
• 3.2 重组干扰载体干扰效率测定
• 3.3 RNAi 对X 射线作用的HeLa 细胞survivin 基因转录水平的影响
• 3.4 RNAi 对X 射线作用的HeLa 细胞survivin 蛋白表达的影响
• 3.5 RNAi 对X 射线作用的HeLa 细胞凋亡的影响
• 3.6 RNAi 对X 射线作用的HeLa 细胞周期分布的影响
• 3.7 RNAi 对X 射线作用的HeLa 细胞染色体数目变化的影响
• 第四章 讨论
• 1. SURVIVIN 在肿瘤细胞中的表达
• 2. SURVIVIN 与细胞凋亡
• 3. SURVIVIN 与染色体不稳定性
• 4. 研究展望
• 结论
• 参考文献
• 攻博期间发表的学术论文及其他成果
• 中文摘要
• Abstract
• 致谢