PPARγ2激动剂筛选模型的建立及其在黑茶提取物调节血糖功能评价中的应用

论文摘要

随着经济条件的改善、生活方式的改变,糖尿病的发病率呈明显增高的趋势,尤以Ⅱ型糖尿病为特征。研究表明,胰岛素抵抗在Ⅱ型糖尿病的发生、发展中起着极为重要的作用。过氧化物酶体增殖物激活受体y2（PPARy2）属Ⅱ型核受体超家族中的成员,为配体依赖性转录因子。目前已知PPARy2存在多种配体和激活物。噻唑烷二酮类药物（TZDs）是PPARy2的激动剂已用于Ⅱ型糖尿病的治疗。TZDs作为胰岛素增敏剂,调控与胰岛素效应有关的多种基因转录,调节葡萄糖的产生、转运、利用以及脂肪代谢,增强胰岛素的作用,降低胰岛素抵抗性。本研究在分子水平上建立PPARy2激动剂筛选模型,用于黑茶提取物降糖活性的筛选,以期发现新的抗糖尿病的药物。本文主要研究结果如下：1.进行了PcDNA3.1 （+）-PP ARy2表达载体和PG13-PPRE×3-luc报告载体的构建、扩增与提取,经测序证实无突变插入且方向正确。2.本试验对比了两种从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA小片段的方法（煮沸法和水浴法）,并用无水乙醇和3mol/L醋酸钠共沉淀纯化DNA小片段。结果显示：水浴法比煮沸法的回收率高,水浴法结合乙醇沉淀法还具有经济和操作简单的优点,可以广泛应用。3.初步建立了PPARy2激动剂的筛选模型。将PcDNA3.1（+）-PPARy2表达载体、PGl3-PPRE×3-luc报告载体和PRL-TK内参载体共转染到HEK 293T细胞中,通过测定报告基因活性来考察阳性药马来酸罗格列酮对PPARy2信号通路的影响。用CCK8法考察马来酸罗格列酮对HEK 293T细胞增殖功能的影响。在0.1-1000μmol/L马来酸罗格列酮浓度下处理不同时间,450 nm处测OD值,结果表明5种浓度的马来酸罗格列酮处理24 h时对细胞增殖均无影响；从48 h开始,马来酸罗格列酮在100、1000μmol/L浓度时对细胞增殖有影响。通过对转染中不同的质粒比例,转染HEK 293T细胞表达Luc的效率比较,确定了最佳转染质粒比（表达质粒/报告质粒/参质粒为0.06/0.12/0.02μg）。通过马来酸罗格列酮对诱导Luc表达率的量效和时效探讨,发现马来酸罗格列酮对Luc的诱导表达呈现出量效和时效的依赖性。结果表明,在0.1μmol/L马来酸罗格列酮浓度下处理24 h诱导表达率最高。所以,马来酸罗格列酮的最佳诱导浓度为0.1μmol/L,最佳诱导时间为24 h。4.应用此模型对8种黑茶提取物进行了PPARy2激动活性的初步筛选。其中,白沙溪天尖、金尖、青砖茶、茯砖茶和千两茶的激动效果较明显；金华天成茶、龙润普洱熟饼和六堡茶也呈现一定的激动活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 PPARγ的研究进展
• 1.1 PPARγ的结构和组织分布
• 1.2 PPARγ的配体
• 1.3 PPARγ的作用机制
• 1.4 PPARγ的功能
• 1.4.1 PPARγ与脂肪细胞分化及脂代谢
• 1.4.2 PPARγ与胰岛素抵抗及糖代谢
• 1.4.3 PPARγ与炎症
• 1.4.4 PPARγ与高血压
• 1.4.5 PPARγ与动脉粥样硬化
• 1.4.6 PPARγ与肿瘤
• 2 PPARγ2作为新药作用靶点的意义
• 3 报告基因的种类及其在药物筛选中的应用
• 4 研究的目的和意义
• 5 研究的主要内容
• 5.1 PcDNA3.1（+）-PPARγ2表达载体的构建
• 5.2 PGl3-PPRE×3-1uc报告载体的构建
• 5.3 PPARγ2激动剂筛选模型的建立
• 5.4 PPARγ2激动剂筛选模型在黑茶提取物调节血糖功能评价中的应用
• 第二章 PcDNA3.1（+）-PPARγ2表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料、仪器与试剂
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 PPARγ2全基因的合成与鉴定
• 1.2.2 PcDNA3.1（+）-PPARγ2表达载体的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 PPARγ2全基因的合成与鉴定
• 2.2 PcDNA3.1（+）-PPARγ2表达载体的构建
• 2.2.1 载体的提取
• 2.2.2 酶切反应
• 2.2.3 重组质粒的转化
• 2.2.4 重组子的鉴定
• 3 讨论
• 3.1 PcDNA3.1（+）-PPARγ2表达载体构建成功的关键
• 3.1.1 影响质粒提取的关键性因素
• 3.1.2 影响切胶回收DNA的关键性因素
• 4 本章小结
• 第三章 PGl3-PPRE×3-1uc报告载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料、仪器与试剂
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 PPRE序列的合成与鉴定
• 1.2.2 PGl3-PPRE×3-1uc报告载体的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 PPRE序列的合成与鉴定
• 2.2 PGl3-PPRE×3-1uc报告载体的构建
• 2.2.1 酶切反应
• 2.2.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳回收PPRE
• 2.2.3 重组质粒的转化
• 2.2.4 重组子的鉴定
• 3 讨论
• 从聚丙烯酰胺凝胶上回收纯化DNA的总结
• 4 本章小结
• 第四章 PPARγ2激动剂筛选模型的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料、仪器与试剂
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.2 马来酸罗格列酮对细胞增殖功能的影响（CCK8法）
• 1.2.3 瞬时转染和报告基因检测
• 1.2.4 共转染过程中质粒比的优化
• 1.2.5 马来酸罗格列酮对Luc诱导表达的量效关系
• 1.2.6 马来酸罗格列酮对Luc诱导表达的时效关系
• 1.2.7 统计学处理
• 2 结果与分析
• 2.1 马来酸罗格列酮对细胞增殖功能的影响（CCK8法）
• 2.2 共转染过程中质粒比的优化
• 2.3 马来酸罗格列酮对Luc诱导表达的量效关系
• 2.4 马来酸罗格列酮对Luc诱导表达的时效关系
• 3 讨论
• 3.1 CCK8法的优越性
• 3.2 脂质体转染的注意事项
• 3.3 双荧光素酶报告基因系统的优点
• 4 本章小结
• 第五章 PPARγ2激动剂筛选模型在黑茶提取物调节血糖功能评价中的应用
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料、仪器与试剂
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 黑茶水提物的制备
• 1.2.2 细胞培养
• 1.2.3 8种黑茶水提物对细胞增殖功能的影响
• 1.2.4 黑茶提取物的筛选
• 1.2.5 统计学处理
• 2 结果与分析
• 2.1 8种黑茶水提物对细胞增殖功能的影响
• 2.2 黑茶提取物的筛选
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 第六章 全文总结
• 1 本文主要研究结果
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 在读期间的科研学术成果目录
• 附表