人工小RNA沉默拟南芥植物型PEPC基因的研究

论文摘要

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）是一种具有多种生理功能的细胞质酶,广泛分布于高等植物、藻类和多数细菌中。在C4和CAM植物中,PEPC负责光合作用中无机碳的初始同化；C3植物的PEPC在促进TCA循环中间代谢物的回补、协调碳和氮的代谢等方面有重要作用,被认为是控制C3植物蛋白质与油脂含量比的一个关键酶。同时,PEPC可能与植物对逆境胁迫的响应有密切关系。拟南芥（Arabidopsis thaliana）与油菜（Brassica napus L.）同属十字花科芸薹属,亲缘关系非常近,在编码区,基因平均相似性达85%左右,因此,拟南芥相关的功能基因研究对油菜育种具有重要参考价值。为探索植物型PEPC基因对模式植物拟南芥脂肪酸含量和组分,以及抗逆性等方面的影响,本试验构建了同时沉默拟南芥植物型PEPC基因家族（Atppcl、Atppc2和Atppc3）的人工小RNA植物表达载体,用花序浸染法转化拟南芥,成功获得转化植株,并对转化植株进行了相关的分子鉴定和功能分析。主要研究结果如下：1.登录人工小RNA设计网站WMD3,提交Atppcl、Atppc2和Atppc3的cDNA序列,设计相应扩增引物,以pRS300质粒为模板（含拟南芥内源miR319a前体骨架）,采用重叠PCR的方法克隆了人工小RNA的前体片段,连入双元表达载体pFGC5941,构建了沉默Atppc1、Atppc2和Atppc3的人工小RNA表达载体pFGC-amiAtppc123,利用花序浸染法转化野生型拟南芥。2.经过除草剂初步筛选,T1代拟南芥幼苗大部分黄化枯死,少数植株正常生长,具有除草剂抗性。提取除草剂抗性苗的叶片DNA进行PCR检测,获得18株T1代转化植株。人工小RNA的半定量RT-PCR的分析表明,在转化植株中,人工小RNA进行了超量表达。对Atppc1、Atppc2和Atppc3的半定量RT-PCR分析显示：与对照相比较,转化植株Atppc1的表达量显著下调,Atppc2和Atppc3的表达量无明显变化。3.在NaCl胁迫下,对照和转化植株中,Atppcl和Atppc3表现的更为敏感,在盐处理期间,它们的表达水平呈现不同变化趋势,而Atppc2的表达则相对稳定。T2代转化株系种子含油量与对照相比没有明显差异,而脂肪酸组分的测定结果显示,转化株系种子低碳饱和脂肪酸的比例稍高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 缩略表
• 第一章 文献综述
• 1 植物中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能研究
• 1.1 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶与光合作用
• 1.2 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶与环境胁迫
• 1.3 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶与蛋白质/脂类代谢
• 1.4 拟南芥中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
• 2 RNA介导的植物基因沉默技术
• 2.1 共抑制和反义RNA技术
• 2.2 hpRNAi技术
• 2.3 病毒诱导的基因沉默（VIGS）
• 2.4 人工小RNA技术
• 2.5 人工ta-siRNA技术
• 3 本研究的内容和意义
• 第二章 拟南芥植物型PEPC基因amiRNA表达载体的构建及转化拟南芥
• 1 材料和方法
• 1.1 植物材料、菌株和载体
• 1.2 酶和试剂
• 1.3 拟南芥的种植
• 1.4 amiRNA表达载体的构建
• 1.4.1 amiRNA的引物设计、扩增及回收
• 1.4.2 克隆载体pGEM-amiAtppc123的构建及鉴定
• 1.4.3 表达载体pFGC-amiAtppc123的构建及转化农杆菌
• 1.5 转化拟南芥
• 1.5.1 农杆菌的扩大培养
• 1.5.2 花序浸染法转化拟南芥
• 2 结果与分析
• 2.1 amiRNA与靶基因的结合位点
• 2.2 amiRNA前体片段的克隆
• 2.3 克隆载体的酶切鉴定
• 2.4 表达载体的酶切鉴定
• 2.5 农杆菌的PCR鉴定
• 3 讨论
• 第三章 转化植株的分子鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 酶和试剂
• 1.3 转化植株的抗性鉴定
• 1.4 转化植株的PCR检测
• 1.4.1 CTAB法小量提取基因组DNA
• 1.4.2 引物设计、PCR反应体系及扩增程序
• 1.5 转化植株amiRNA的表达分析
• 1.5.1 Trizol法提取植物组织总RNA
• 1.5.2 amiRNA的引物设计、逆转录及半定量RT-PCR
• 1.6 转化植株Atppc1、Atppc2和Atppc3的表达分析
• 1.6.1 总RNA的提取及逆转录
• 1.6.2 PCR引物的设计
• 1.6.3 PCR反应体系和程序
• 2 结果与分析
• 2.1 转化植株的除草剂筛选
• 2.2 转化植株的PCR检测
• 2.3 转化植株中amiRNA的表达
• 2.4 转化植株中Atppc1、Atppc2和Atppc3的表达
• 3 讨论
• 第四章 转化植株的特性分析
• 1 材料和方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 酶和试剂
• 1.3 盐胁迫下Atppc1、Atppc2和Atppc3的表达分析
• 1.3.1 材料准备
• 1.3.2 总RNA的提取及逆转录
• 1.3.3 PCR反应体系和程序
• 1.4 种子含油量的测定
• 1.4.1 材料准备
• 1.4.2 测定方法
• 1.5 种子脂肪酸组分的测定
• 1.5.1 材料准备
• 1.5.2 测定方法
• 2 结果与分析
• 2.1 盐胁迫下Atppc1、Atppc2和Atppc3的表达
• 2.2 转化植株种子的含油量分析
• 2.3 转化植株种子脂肪酸组分的分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录