猪肺炎支原体P159、P216基因片段的表达及黏附活性的研究

论文摘要

猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）是引起猪气喘病的主要病原,Mhp与猪呼吸道上皮细胞纤毛的特异性黏附是引起该病的先决条件,Mhp表面的黏附因子在致病过程中起到重要作用。本试验利用原核表达系统表达了Mhp黏附因子P159、P216蛋白的主要抗原片段,并对这两种蛋白的黏附活性进行了初步研究,本研究主要从以下几个方面展开：1 参考GenBank登录的猪肺炎支原体（Mhp）P159基因序列,选取抗原性、亲水性较好的片段,利用Primer5.0软件设计合成引物,通过PCR扩增目的基因,将扩增的目的基因插入表达载体pET-28a（+）中,构建重组表达质粒pET-28a（+）/P159.将重组质粒pET-28a（+）/P159导入大肠杆菌BL21（DE3）进行表达,经1%IPTG诱导表达5h后,蛋白的表达量最高,并用Protino Ni-TED 2000 Packed Columns进行亲和纯化,得到纯净的目的蛋白。Western-blot分析表明表达蛋白具有良好的反应原性。2参考GenBank登录的猪肺炎支原体（Mhp） P216基因序列,选取抗原性、亲水性较好的片段,利用Primer5.0软件设计合成引物,通过PCR扩增出目的基因,采用SOE-PCR方法将基因序列中三个编码色氨酸的TGA稀有密码子突变为TGG,突变成功后,将突变后的目的基因插入表达载体pET-32a（+）中,构建重组表达载体pET-32a（+）/P216.将重组质粒pET-32a（+）/P216导入大肠杆菌BL21（DE3）进行表达,经1%IPTG诱导表达4h后,蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体的形式存在,先用8M尿素将蛋白进行变性,然后采用透析的方法将表达蛋白复性成有生物学活性的蛋白,最后用Protino Ni-TED 2000 Packed Columns进行亲和纯化,得到纯净的目的蛋白。Western-blot分析表明表达蛋白具有良好的反应原性。3 采集健康猪的气管制备猪呼吸道上皮细胞纤毛蛋白,将蛋白稀释成10μg/mL包被微量滴定板,用上述表达的两种蛋白做微量滴定板试验。试验发现这两种蛋白都能与猪呼吸道纤毛发生黏附作用。4采用SJPL细胞做黏附模型,探索猪肺炎支原体对SJPL细胞的黏附作用。猪肺炎支原体232株与SJPL细胞孵育4h后,加入Mhp/P46单克隆抗体（1：1000稀释）孵育90min,再加入羊抗鼠IgG-FITC（1：100稀释）孵育60min,荧光显微镜观察发现：猪肺炎支原体232株对SJPL细胞具有较强的黏附作用。5在证明猪肺炎支原体对SJPL细胞具有黏附作用的基础上,探索表达蛋白的黏附活性。猪肺炎支原体P159、P216蛋白抗原片段分别与SJPL细胞孵育4h后,再将猪肺炎支原体232株与蛋白黏附过的SJPL细胞孵育4h,加入Mhp/P46单克隆抗体（1：1000稀释）孵育90min,再加入羊抗鼠IgG-FITC（1：100稀释）孵育60min。采用流式细胞仪检测荧光强弱,结果显示,这两种蛋白都能对猪肺炎支原体黏附SJPL细胞产生抑制作用,从而说明选取的P159、P216蛋白抗原片段具有良好的黏附活性。本试验利用原核系统表达了猪肺炎支原体P159、P216基因片段,利用微量滴定板试验和间接免疫荧光试验研究了两种表达蛋白的黏附活性.通过这些研究,初步建立了猪肺炎支原体蛋白黏附模型,也为猪肺炎支原体黏附机制、检测方法以及基因工程疫苗的研制打下坚实基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语及符号
• 第一篇 文献综述
• 1 猪肺炎支原体研究进展
• 1.1 猪肺炎支原体简介
• 1.2 猪肺炎支原体的培养和分离
• 1.3 猪肺炎支原体的致病机理
• 2 猪肺炎支原体黏附因子的研究进展
• 2.1 P97蛋白
• 2.2 P102蛋白
• 2.3 P159蛋白
• 2.4 P216蛋白
• 2.5 P116蛋白
• 2.6 Mhp271蛋白
• 2.7 Mhp107蛋白
• 第二篇 研究内容
• 第一章 猪肺炎支原体P159基因片段的表达及鉴定
• 1 材料
• 1.1 质粒和菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要溶液配方
• 2 方法
• 2.1 引物的设计与合成
• 2.2 模板的制备
• 2.3 Mhp/P159基因的PCR扩增
• 2.4 Mhp/P159基因的回收纯化
• 2.5 Mhp/P159基因与pMD18-T载体的连接
• 2.6 连接产物的转化
• 2.7 重组质粒DNA的提取、鉴定及测序
• 2.8 原核表达载体pET-28a（+）/P159的构建
• 2.9 连接产物的转化、重组质粒DNA的提取及鉴定
• 2.10 重组质粒的诱导表达及SDS-PAGE检测
• 2.11 最佳诱导条件的确定
• 2.12 融合蛋白的纯化
• 2.13 表达产物的Western-blot检测
• 3 结果与分析
• 3.1 猪肺炎支原体P159基因的扩增
• 3.2 重组质粒pMD18-T/P159的鉴定
• 3.3 重组质粒pET-28a（+）/P159的鉴定
• 3.4 重组蛋白的SDS-PAGE结果
• 3.5 重组蛋白的表达条件的优化
• 3.6 重组蛋白的纯化结果
• 3.7 重组蛋白的免疫印迹分析
• 4 讨论
• 小结
• 第二章 猪肺炎支原体P216基因片段的表达及鉴定
• 1 材料
• 1.1 质粒和菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要溶液配方
• 2 方法
• 2.1 引物的设计与合成
• 2.2 模板的制备
• 2.3 突变前Mhp/P216基因的PCR扩增
• 2.4 突变前Mhp/P216基因的回收纯化
• 2.5 突变前Mhp/P216基因与pMD18-T载体的连接
• 2.6 连接产物的转化
• 2.7 重组质粒DNA的提取、鉴定及测序
• 2.8 Mhp/P216基因的的突变
• 2.9 突变后Mhp/P216基因的回收纯化与测序
• 2.10 原核表达载体pET-32a（+）/P216的构建
• 2.11 连接产物的转化、重组质粒DNA的提取及鉴定
• 2.12 重组质粒的诱导表达及SDS-PAGE检测
• 2.13 最佳诱导条件的确定
• 2.14 融合蛋白的纯化
• 2.15 表达产物的Western-blot检测
• 3 结果与分析
• 3.1 Mhp/P216基因（突变前）的扩增
• 3.2 重组质粒pMD18-T/P216（突变前）的鉴定
• 3.3 猪肺炎支原体P216基因的突变结果
• 3.4 重组质粒pET-32a（+）/P216的鉴定
• 3.5 重组蛋白的SDS-PAGE结果
• 3.6 重组蛋白的存在状态分析
• 3.7 重组蛋白的表达条件的优化
• 3.8 重组蛋白的纯化结果
• 3.9 重组蛋白的免疫印迹分析
• 4 讨论
• 小结
• 第三章 P159、P216蛋白抗原片段黏附活性的研究
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要溶液配方
• 2 方法
• 2.1 猪肺炎支原体232株的培养
• 2.2 SJPL细胞的培养
• 2.3 纤毛受体蛋白与P15P、P216蛋白抗原片段的微量滴定板试验
• 2.4 Mhp232株与SJPL细胞的黏附试验
• 2.5 P159、P216蛋白抗原片段对黏附抑制试验
• 3 结果与分析
• 3.1 微量滴定板试验结果
• 3.2 Mhp232株与SJPL细胞的黏附试验
• 3.3 Mhp/P159、Mhp/P216蛋白抗原片段黏附抑制试验结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢