论文摘要
第一部分妊娠期糖尿病小鼠传代模型的建立及子代表型检测目的：研究宫内高糖环境出生小鼠子一代及子二代的生长发育及糖代谢状况,明确宫内高糖环境所致成年期疾病的发病风险及隔代遗传效应。材料和方法：建立妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus,GDM）小鼠传代模型,子一代（F1-GDM）出生后由血糖正常的母鼠代为哺乳直至3周龄断乳。检测对照组（C）与F1-GDM出生体重、3周龄及8周龄体重、胰腺比重；血糖仪检测空腹及餐后随机血糖水平并进行糖耐量试验；ELISA试剂盒检测空腹及餐后胰岛素水平；HE染色观察胰岛形态,电镜观察胰岛细胞超微结构。将对照组及GDM出生子一代雌雄小鼠在性成熟期两两1：1自然交配,出生子二代小鼠（Cd♂-C♀, GDM♂-c♀,C♂-GDM♀,GDM♂-GDM♀）,出生体重、3周龄及8周龄体重、胰腺比重、血糖、胰岛素、胰岛形态及超微结构检测同子一代。结果：宫内高糖环境出生的子一代小鼠出生体重显著降低,经过血糖正常的母鼠代为哺乳后,3周龄和8周龄的体重与对照组无显著差异。虽然生长早期（3周龄）糖耐量正常,但胰腺比重增加,透射电镜显示胰岛细胞中内质网明显肿胀、结构紊乱,在8周龄时出现糖耐量异常；子二代小鼠GDM♂-C及GDM♂-GDM♀组出生体重显著增加,C♂-GDM♀出生体重无显著改变,具有明显的亲源性遗传效应,3周龄和8周龄的体重与对照组无显著差异；但是在生长早期（3周龄）就发生糖耐量异常,胰腺比重增加；透射电镜显示3周龄时胰岛细胞中内质网明显肿胀、结构紊乱,至8周龄时胰岛细胞内质网结构有所修复,然而8周龄时的糖耐量仍然异常。进一步分析发现,宫内高糖环境出生的子一代和子二代雄鼠糖耐量异常表型均较雌鼠更加明显。结论：宫内高糖环境出生子一代及子二代小鼠出生体重及糖代谢状况异常,子代雄鼠糖耐量异常表型较雌鼠更加明显；子一代父源性因素对子二代的生长及糖代谢起主导作用,具有亲源性遗传特征,提示表观遗传机制可能在子代及隔代疾病发生中起重要作用。第二部分官内高糖环境出生子代小鼠胰岛功能、印记基因表达及甲基化状况目的：研究宫内高糖环境出生小鼠子一代及子二代的胰岛功能、胰岛细胞印记基因Igf2、H19及Plagll的表达以及Igf2/H19差异甲基化区（differentially methylated region, DMR）的甲基化状况,分析胰岛细胞发育及糖尿病发病相关印记基因的表达差异,评估宫内高糖子代及隔代发生甲基化异常的风险,探索胰岛功能、印记基因表达与甲基化的关系。材料和方法：用胆总管穿刺灌注胶原酶方法分离纯化8周龄小鼠胰岛细胞,体外葡萄糖刺激胰岛素释放实验检测胰岛功能,对与胰岛细胞发育及糖尿病发病密切相关的印记基因Igf2、H19及Plagll行实时定量PCR检测。分离纯化17日龄胎鼠胰岛细胞,体外生理糖浓度或高糖环境培养24h后对印记基因实时定量PCR检测。采用亚硫酸氢盐测序的方法检测小鼠胰岛Igf2 DMRO、Igf2 DMR1、Igf2 DMR2和H19 DMR的甲基化状态。结果：宫内高糖环境出生子一代及子二代小鼠胰岛细胞表现为葡萄糖刺激后胰岛素释放功能受损,Igf2及H19基因表达均显著低于对照组,Plagll基因表达无明显改变；子一代和子二代雄鼠胰岛印记基因表达异常均较雌鼠更加明显。胎鼠胰岛细胞经体外高糖培养后,Igf2及H19基因表达均显著低于对照培养组。对照组、F1-GDM及GDM♂-GDM♀中Igf2 DMRO的12个CpG位点、Igf2 DMR1的4个CpG位点基本均为高甲基化,三组标本间Igf2 DMRO和Igf2 DMR1的甲基化状况相似。在对照组中,Igf2 DMR2的13个CpG位点和H19 DMR的12个CpG位点均表现为差异甲基化,而F1-GDM及GDM♂-GDM♀组中Igf2 DMR2和H19 DMR的甲基化程度均较对照组明显增高。结论：宫内高糖环境出生子代小鼠胰岛的葡萄糖刺激后胰岛素释放功能受损,是导致子代糖耐量异常表型的主要原因之一。印记基因Igf2、H19表达降低,可能为胰岛细胞功能异常的机制之一。宫内高糖环境出生子一代及子二代小鼠胰岛Igf2/H19差异甲基化区中Igf2 DMR2和H19 DMR的甲基化水平较对照组增高,为印记基因Igf2、H19表达降低的主要机制。第三部分宫内高糖环境出生子代小鼠胎盘基因组学及性腺印记基因表达目的：研究宫内高糖环境出生子一代及子二代小鼠胎盘基因表达谱与对照组是否存在差异,阐明其差异程度,分析宫内高糖环境出生子一代及子二代小鼠胎盘中印记基因的表达差异,并筛选关键性的差异基因。同时研究宫内高糖环境出生子一代小鼠性腺中印记基因表达状况,分析子一代性腺中同源序列与人类印记疾病密切相关的印记基因的表达差异。材料和方法：应用Affymetrix公司的Mouse Genome 430 2.0芯片,以对照组、F1-GDM及GDM♂-GDM♀组18日龄小鼠胎盘各3例为研究对象,利用芯片显著性分析（significance analysis of microarray, SAM）比较两组标本基因表达,采用分层聚类、GO（gene ontology）分类及信号通路（pathway）分析对差异表达基因进行数据分析。对子一代及子二代各组胎盘差异表达的非印记及印记基因行实时定量PCR检测。对照组及宫内高糖环境出生子一代8周龄（成年期）小鼠,雄鼠取睾丸,雌鼠取卵巢,选择同源序列与人类印记疾病密切相关的印记基因行实时定量PCR检测。结果：采用SAM法得到对照组与F1-GDM组之间差异最为显著的124个基因,对照组与GDM♂-GDM♀组之间差异最为显著的66个基因,对差异基因进行无监督的分层聚类,可完全区分对照组、F1-GDM组和GDM♂-GDM♀组。根据分子功能、生物进程及细胞组分进行GO分析,显示差异基因中包括与生长、发育、代谢等相关的基因。Pathway分析发现差异基因涉及多条信号通路,包括与细胞黏附、营养代谢、抗原呈递等相关信号通路。实时定量PCR检测12个非印记基因和12个印记基因在对照组和宫内高糖环境出生子一代及子二代小鼠中的表达情况,发现与芯片结果基本一致。宫内高糖环境出生子一代小鼠睾丸及卵巢均存在印记基因表达差异。结论：部分与胎盘发育及代谢相关的非印记基因及印记基因在宫内高糖环境出生子一代及子二代胎盘中表达发生改变,可能影响胎盘功能从而影响胎儿宫内生长发育。宫内高糖可引起子一代小鼠性腺印记基因表达异常,可能是引发隔代遗传的主要机制之一
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