论文摘要
【研究背景及目的】肝纤维化（hepatic fibrosis,HF）是指在各种致病因子如炎症、损伤、药物、遗传因素等的作用下,活化的成纤维细胞或肌成纤维细胞（myofibroblasts, MFs）增多,细胞外基质（extracellular matrix, ECM）大量沉积的病理改变。它是继发于各种形式慢性肝损伤之后组织修复过程中的代偿反应,亦是慢性肝病发展为肝硬化必经的病理过程。肝纤维化为一动态过程,属可逆性病变,因此,阻断、抑制或逆转肝纤维化是治疗慢性肝病的一个重要目标。既往认为,肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）是肌成纤维细胞（myofibroblasts）的最主要来源。但是,晚近研究表明原位间质细胞、上皮细胞及内皮细胞,尤其是胆管细胞和肝细胞也被证明可通过上皮细胞间质转型（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）向肌成纤维细胞转化,表明肝实质的上皮细胞也参与肝纤维化进程。苦参碱是从中国传统中药苦参中提取的一种生物碱,目前的研究发现其抗炎,免疫调节,对小鼠急性肝损伤具有保护作用,并能抗大鼠实验性肝纤维化作用。虽然苦参碱的药理作用广泛,但是活性不高,需要对其进行结构改造,得到活性更强、毒性更低的衍生物。再者,苦参碱的药理作用机制不明确,特别是其靶标蛋白的研究仍是空白。本课题组前期研究发现,苦参碱的羰基氧原子被硫原子取代后,其药理活性大为增强,为此我们对苦参碱进行结构改造,得到40多个苦参碱衍生物。本研究首先对部分苦参碱衍生物进行抗RAW264.7细胞释放TNF-α作用和抑制NF-кB转录活性的筛选,挑选出药效高,毒性低的苦参碱衍生物-19（M-19）;接着对M-19治疗BDL和DMN诱导的大鼠实验性肝纤维化效果进行评价,并初步探讨M-19阻遏EMT进程是其抗肝纤维化的作用机制之一;对M-19抑制TGF-β1诱导原代培养肝细胞、原代培养肝星状细胞和肝星状细胞系HSC-T6细胞EMT进程的阻断,以及对HSC-T6细胞增殖抑制、凋亡诱导作用的研究,阐释M-19抗肝纤维化的多环节机制;通过连续亲和色谱法、竞争亲和色谱法结合MALDI-TOF-TOF质谱鉴定等技术,确证Mat及M-19的特异结合蛋白为核糖体蛋白S5（RPS5）。通过免疫组化和Real-time PCR检测RPS5在纤维化模型大鼠组织中表达变化,以及RPS5在原代肝星状细胞和HSC-T6细胞EMT中的作用研究,推测Mat及M-19可能通过抑制肝脏细胞RPS5的降解或表达水平的下降,而发挥抗肝纤维化作用。【实验方法】一、苦参碱衍生物抗RAW264.7细胞释放TNF-α和抑制NF-кB转录活性筛选（一）采用MTT法测定不同浓度的苦参碱及苦参碱衍生物处理24h,对RAW264.7细胞增殖活性的影响,以比较药物的细胞毒性作用,并确定安全的药理作用浓度范围。（二）分别采用细胞毒结晶紫法和ELISA法对LPS刺激的RAW264.7细胞上清中的TNF-α生物学活性和含量进行测定,比较苦参碱和一系列苦参碱衍生物对RAW264.7细胞释放TNF-α的抑制作用,筛选出高活性衍生物。（三）采用双荧光素酶报告基因法,测定苦参碱衍生物对LPS刺激的RAW264.7细胞NF-кB转录活性的抑制作用,进一步比较药物的药理活性。二、苦参碱及苦参碱衍生物-19抗大鼠实验性肝纤维化作用研究（一）苦参碱及苦参碱衍生物-19对BDL大鼠肝纤维化的抑制作用将雄性SD大鼠随机分为7组,假手术组6只,其余各组10只,分设假手术组、胆总管结扎组、苦参碱衍生物-19 :12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg治疗组,苦参碱50mg/kg治疗组,氧化苦参碱50mg/kg治疗组。钝性分离并结扎胆总管,制备BDL肝纤维化模型。术后3d ,各药物组灌胃给予相应药物处理,假手术组和胆总管接扎组灌胃生理盐水。于接扎后第25d处死大鼠,碱水解法测定各组肝组织羟脯氨酸含量;HE染色观察纤维化程度,Masson和Sirius red染色以计算ECM含量。Real time RT-PCR及免疫组织化学法测定肝组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-平滑肌激动蛋白（α-SMA）、钙粘附蛋白（E-cadherin）、HNF4α和TGF-β1等EMT相关基因的表达。（二）苦参碱及苦参碱衍生物-19对DMN损伤大鼠肝纤维化的抑制作用将雄性SD大鼠随机分为7组,对照组7只,其余各组每组10只,分设假手术组、胆总管结扎组、苦参碱衍生物-19 :12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg治疗组,苦参碱50mg/kg治疗组,氧化苦参碱50mg/kg治疗组。除空白对照组外,其余各组予1%DMN溶液按照10μg/kg的剂量腹腔注射,每周连续注射3次,共注射5w,制备DMN诱导的大鼠肝纤维化模型。于DMN注射第5w起各组灌胃给予相应药物治疗,空白对照组和模型对照组灌胃生理盐水处理。药物治疗3w后处死,观察指标同BDL模型。三、M-19体外抗肝纤维化作用机制研究（一）M-19对原代肝细胞EMT抑制作用研究分离制备原代培养SD大鼠肝细胞,培养2 d后,换成含有2ng/ml TGF-β1无血清培养基,同时设立空白对照组和M-19: 5 ,10,20 umol/L处理组。刺激48h后,提取细胞总RNA。Real time RT-PCR法检测肝细胞核因子4α（HNF4α）、上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）等基因mRNA水平。（二）M-19对原代肝星状细胞EMT抑制作用研究分离制备原代培养SD大鼠肝细胞,培养2 d后,换成含有2ng/ml TGF-β1无血清培养基,同时设立空白对照组和M-19: 5 ,10,20 umol/L处理组。刺激24h后,提取细胞总RNA。Real time RT-PCR法检测α-SMA、Vimentin和Collagen I等基因mRNA水平。（三）M-19对肝星状细胞系HSC-T6 EMT抑制作用研究HSC-T6细胞1.5×105/well分于6孔细胞培养板,培养24h后,加入2ng/ml TGF-β1刺激24h,同时设立空白对照组、苦参碱衍生物-19: 2.5,5,,10umol/L处理组。收集细胞,提取总RNA,Real time RT-PCR检测E-cadherin、α-SMA、CollagenI和CollagenIII基因的mRNA水平（四）M-19对肝星状细胞系HSC-T6增殖抑制作用研究HSC-T6细胞1.5×104/well分于96孔细胞培养板,培养24h后,加入终浓度为0.8 , 4 , 10, 20, 40, 100 umol/L M-19,继续处理24h或48h。MTT法测定细胞的增殖活性（五）M-19诱导肝星状细胞系HSC-T6凋亡作用研究HSC-T6细胞1.5×104/well分于6孔细胞培养板,培养24h后,加入终浓度为10,20,40 umol/L的M-19,继续处理24h,收集细胞,流式细胞术检测凋亡率四、MAT和M-19特异结合蛋白的研究（一）连续亲和色谱法和竞争亲和色谱法分离苦参碱特异结合蛋白采用苦参碱共价结合树脂,从RAW264.7细胞和Jurkat细胞裂解液中分离苦参碱的特异结合蛋白;采用MALDI-TOF-TOF质谱鉴定特异结合蛋白的多肽序列,数据库分析特异结合蛋白为核糖体蛋白S5（RPS5）;再通过RPS5的抗体免疫印迹检测确证。（二）生物素亲和素系统分离M-19特异结合蛋白RPS5构建M-19共价结合生物素,与HSC-T6细胞共孵育6h,利用亲和素从细胞裂解液中分离M-19特异结合蛋白;通过RPS5的抗体免疫印迹检测确证（三）M-19与RPS5共定位分析构建M-19共价结合生物素（biotin-M-19）,与HSC-T6细胞共孵育6h,免疫细胞化学特异性双标biotin-M-19和RPS5,激光共聚焦共定位分析五、RPS5与肝纤维化关系研究（一）RPS5在肝纤维化模型中表达水平变化采用免疫组织化学和Real time RT-PCR技术,检测BDL和DMN致大鼠肝纤维化模型中RPS5蛋白和基因mRNA水平表达变化（二）RPS5在原代肝星状细胞活化过程中表达水平变化采用Real time RT-PCR技术,检测原代分离肝细胞在体外培养自发活化过程中,RPS5基因mRNA表达水平变化（三）TGF-β1刺激下HSC-T6细胞RPS5表达水平变化采用Western blot检测TGF-β1刺激HSC-T6细胞1,3,5,7d RPS5蛋白表达水平变化情况（四）RPS5 siRNA对HSC-T6细胞EMT的影响转染RPS5 siRNA序列si335于HSC-T6细胞,48h后检测E-cadherin和Vimentin蛋白表达情况【实验结果】一、苦参碱及其衍生物抗RAW264.7细胞释放TNF-α和抑制NF-кB转录活性研究30μM的苦参碱衍生物-19,24,对RAW细胞增殖没有抑制作用,且在此浓度时对LPS刺激的RAW264.7细胞释放TNF-α的抑制率分别为70.0%和83.6%（P<0.001）,效果高于其余药物。30μM的苦参碱衍生物-19,24处理组RAW264.7细胞NF-кB转录活性分别降低为LPS刺激组的48.2% （P=0.002）和52%（ P=0.002）。二、苦参碱及苦参碱衍生物-19抗大鼠实验性肝纤维化作用研究（一）苦参碱及苦参碱衍生物-19对BDL大鼠肝纤维化的抑制作用M-19 50mg/kg治疗组与BDL模型组相比:肝组织羟脯氨酸含量（387.74±59.41μg/g） ,较模型对照组（564.18±104.27μg/g）显著减少（ P =0.0003）;肝组织胶原面积减少37% （P<0.001）;免疫组织化学检测显示TGF-β1、α-SAM和Desmin等蛋白表达显著下调,HNF4α的蛋白表达显著上调;Real-time PCR检测结果表明α-SAM、CollagenIII、TGF-β1等基因mRNA显著下降（P<0.05）,同时HNF4αmRNA水平显著上调（P<0.05）。（二）苦参碱及苦参碱衍生物-19对DMN大鼠肝纤维化的抑制作用M-19 50mg/kg治疗组肝组织羟脯氨酸含量（414.97±182.5μg/g） ,较模型对照组（720.3±289.3μg/g）显著减少（ P =0.021）。胶原面积较模型组减少64.5%（P =0.023）。免疫组织化学结果表明,M-19 50mg/kg治疗3w,能显著下调TGF-β1、α-SAM和Desmin的表达,同时上调HNF-4α,E-cadherin的表达。Real-time PCR检测结果表明M-19 50mg/kg治疗组与模型组相比α-SMA水平显著下降（P =0.013）,而Ecadherin水平显著上升（P =0.004）。三、M-19体外抗肝纤维化作用机制研究Real-time PCR检测结果表明:原代肝细胞经M-19 20μM处理48h, HNF4α和Ecadherin的mRNA水平分别为（87.8±3.7%）和（91.41±5.4%）,与TGF-β1 2ng/ml诱导组相比（68.3±6.9%, P =0.007 ）和（78.9±6.1%, P =0.006）显著升高。M-19能剂量依赖性的下调TGF-β1 2ng/ml诱导原代肝星状细胞α-SMA（P <0.001）、Vimentin（P =0.021）和CollagenImRNA（P =0.017）水平升高。对于TGF-β1 2ng/ml刺激的HSC-T6细胞,M19-10umol/L处理组能显著降低α-SMA（P =0.022）和CollagenII（IP<0.001）的mRNA水平,同时上调E-cadherin mRNA水平（P =0.007）。MTT检测结果表明M-19可浓度依赖性的抑制HSC-T6增殖,40umol/L的M-19分别处理HSC-T6细胞24h和48h,对细胞的增殖抑制率分别为79%和94.5%。流式细胞术检测HSC-T6细胞凋亡率发现,M-19 40umol/L处理24h,能诱导21.14%的HSC-T6细胞凋亡。四、MAT和M-19特异结合蛋白的研究采用连续亲和色谱法和竞争色谱法从Jurkat或RAW264.7细胞裂解液中分离出23KD的特异性结合蛋白条带;MALDI-TOF-TOF质谱鉴定特异结合蛋白的多肽序列片段YLPHSAGR ,LTNSMMMHGR,QAVDVSPLR等,与人核糖体蛋白S5（Ribosomal protein S 5,RPS5）匹配,Western blot检测结果确证RPS5为23KD处特异结合蛋白条带。由M-19共价结合生物素分离得到的HSC-T6细胞中特异结合蛋白,经Western blot确证同样为RPS5;免疫细胞化学双标技术检测表明,在HSC-T6细胞内M-19与RPS5特异性结合。五、RPS5与肝纤维化关系研究免疫组织化学和Real-time PCR检测结果表明,肝纤维化过程中RPS5表达下调,而M-19治疗组能显著抑制其下调。原代培养肝星状细胞自发活化过程中,RPS5 mRNA水平在第3d就降至64%,之后维持该水平至第7d。免疫印迹检测结果表明,TGF-β1 2ng/ml刺激7天,HSC-T6细胞RPS5的表达逐渐下调。转染RPS5 siRNA 335后,HSC-T6细胞Vimentin蛋白表达上调,同时E-cadherin表达下调。【结论】一、M-19和M-24对RAW264.7细胞的增殖活性抑制作用较小,对LPS刺激RAW细胞释放TNF-α抑制作用好于苦参碱及同类苦参碱衍生物,并具有抑制NF-кB转录活性作用。二、M-19可抑制BDL或DMN肝纤维化大鼠肝组织EMT进程,降低肝脏ECM沉积,具有抗肝纤维化作用。三、M-19抗肝纤维化作用机制与其抑制肝细胞和肝星状细胞的EMT进程,抑制肝星状细胞增殖,诱导肝星状细胞凋亡有关。四、核糖体蛋白S5是苦参碱和M-19的特异结合蛋白。五、核糖体蛋白S5的降低可促进EMT发生,导致肝纤维化。
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