南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建

论文摘要

谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase, GPx）与谷胱甘肽硫转移酶（Glutathione S-transferase, GST）是谷胱甘肽抗氧化系统中的重要酶类,能够清除体内H2O2和许多有机氢过氧化物,并且具有解毒功能。S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase, SAHH）是一种细胞内广泛存在的酶,在调节生物体转甲基化反应中占据重要地位。本实验通过RT-PCR及RACE-PCR技术成功克隆了南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L GPx、GST和SAHH基因全长,分别命名为ICE-LGPx、ICE-LGST和ICE-LSAHH,并对其做了全面的生物信息学分析。还研究了ICE-LGPx和ICE-LGST基因在不同盐度和CdCl2作用前后的表达变化并构建了ICE-LGPx和ICE-LGST基因的原核表达载体。ICE-LGPx基因全长1956 bp,编码255个氨基酸。预测分子量为28.3 KD,理论等电点为9.07。ICE-LGPx基因在进化上与绿藻类如Micromonas sp. RCC299和Micromonas pusilla亲缘关系较为相近。在序列3’非编码区末端有一102 bp的SECIS （硒代半胱氨酸插入序列）元件。ICE-LGPx基因的三维结构模拟结果显示该蛋白含有5个α螺旋和7个β折叠;ICE-LGST基因的全长966 bp,编码321个氨基酸。推导其分子量为24.1 KD,理论等电点为9.69。ICE-LGST基因与莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）线粒体GST同源性最高,蛋白质亚细胞定位预测结果同样显示ICE-LGST基因可能来源于线粒体。三维结构显示ICE-LGST亚基共有9个α-螺旋和4个β-折叠,并且具有两个基本功能域:GSH结合位点和底物结合位点;ICE-LSAHH全长1844 bp,编码487个氨基酸。预测的分子量为53 KD,等电点为5.16。氨基酸的同源比对分析表明SAHH是一个进化上比较保守的蛋白,与其他物种SAHH基因具有较高的同源性。系统进化树结果显示ICE-LSAHH与杜氏盐藻（Dunaliella salina）、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、小球藻（Chlorella variabilis）等有较近亲缘关系。三维结构显示其亚基共有20个α-螺旋和12个β-折叠,并且由3个结构域组成:大的N端底物结合域、NAD结合域和C端域。应用实时荧光定量PCR技术（Real-time PCR）,以ICE-Lβ-actin和ICE-L GAPDH基因为内参照,研究了ICE-LGPx和ICE-LGST基因在不同盐度和不同浓度CdCl2(μmol·L-1)作用前后的表达变化。结果表明,在不同NaCl浓度胁迫作用下ICE-LGPx和ICE-LGST基因均有表达,且呈先上升后下降的趋势。ICE-LGPx在盐度11和66时,24 h达到表达量最大值;在盐度22和99时,12 h达到表达量最大值。ICE-LGST在低盐度11和22时,24 h达到最大表达量,在高盐度99时12 h表达量最大。ICE-LGST基因对重金属镉的响应高于ICE-LGPx。ICE-LGPx基因在CdCl2浓度为10和20μmol·L-1时,表达量最大值分别出现在48 h和24 h;CdCl2浓度为30和40μmol·L-1时在12 h时即达到最大值。ICE-LGST基因在CdCl2浓度为10和20μmol·L-1时,表达量最大值分别出现在36 h和48 h;CdCl2浓度为30和40μmol·L-1时表达量最大值分别出现在36 h和12 h。选用了pET-28a原核表达载体,将南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L GPx基因和GST基因与其连接,成功地构建了原核表达载体pET28-GPx与pET28-GST。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 南极冰藻
• 1.1.1 南极冰藻的生长环境
• 1.1.2 南极冰藻的国内外研究现状及生态学意义
• 1.1.3 南极冰藻的应用前景
• 1.1.4 展望
• 1.2 谷胱甘肽的性质及生理功能
• 1.3 谷胱甘肽过氧化物酶
• 1.3.1 动物谷胱甘肽过氧化物酶的分类和结构
• 1.3.2 谷胱甘肽过氧化物酶的生物学功能
• 1.3.3 植物中的谷胱甘肽过氧化物酶
• 1.4 谷胱甘肽硫转移酶
• 1.4.1 谷胱甘肽硫转移酶的分类和结构
• 1.4.2 谷胱甘肽硫转移酶的生物学功能
• 1.5 S-腺苷同型半胱氨酸水解酶
• 1.5.1 S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的基本结构
• 1.5.2 SAHH 的国内外研究进展
• 1.6 研究目的及意义
• 1.6.1 研究目的
• 1.6.2 研究意义
• 2 GPx、GST 和SAHH 全长基因的克隆及序列分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 藻种来源
• 2.1.2 质粒与受体菌
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要工具酶及试剂盒
• 2.1.5 主要溶液和试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 冰藻的培养
• 2.2.2 南极冰藻总RNA 的提取
• 2.2.3 感受态细胞的制备
• 2.2.4 南极冰藻GPx、GST、SAHH 基因的RACE 克隆
• 2.2.5 生物信息学分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 总RNA 的质量鉴定
• 2.3.2 3’RACE cDNA 一链的合成
• 2.3.3 ICE-LGPx 基因的克隆结果与分析
• 2.3.4 ICE-LGST 基因的克隆结果与分析
• 2.3.5 ICE-LSAHH 基因的克隆结果及分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 ICE-LGPx 基因
• 2.4.2 ICE-LGST 基因
• 2.4.3 ICE-LSAHH 基因
• 3 南极冰藻在不同条件下的差异表达研究
• 3.1 试剂及仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 实验设计
• 3.2.3 总RNA 的DNase Ⅰ消化
• 3.2.4 扩增效率的确定
• 3.2.5 荧光定量PCR
• 3.2.6 数据统计与分析
• 3.3 结果与分析
• 2浓度下的表达分析'>3.3.1 ICE-LGPx 和ICE-LGST 基因在不同CdCl₂浓度下的表达分析
• 3.3.2 ICE-LGPx 与ICE-LGST 基因在不同盐度下的表达分析
• 3.4 讨论
• 4 原核表达载体的构建
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 藻种与培养条件
• 4.1.2 质粒与受体菌
• 4.1.3 主要工具酶及试剂盒
• 4.1.4 主要试剂
• 4.1.5 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 重组表达质粒pET28-GPx 的构建
• 4.2.2 重组表达质粒pET28-GST 的构建
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 重组表达质粒pET28-GPx 的构建
• 4.3.2 重组表达质粒pET28-GST 的构建
• 4.4 讨论
• 5 结论
• 5.1 Chlamydomonas sp. ICE-LGPX 基因的克隆
• 5.2 Chlamydomonas sp. ICE-LGST 基因的克隆
• 5.3 Chlamydomonas sp. ICE-LSAHH 基因的克隆
• 5.4 ICE-LGPX 与ICE-LGST 差异表达分析
• 5.5 原核表达载体的构建
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简介
• 导师简介