农杆菌介导转化及原生质体融合法选育红曲菌Monacolin K高产株

论文摘要

红曲菌发酵产物中含有一种胆固醇合成抑制剂-Monacolin K,它与土曲霉中发现的lovastatin系同一物质,都具有抑制生物体内胆固醇合成途径中关键酶HMG-CoA还原酶活性的作用,从而调节生物体内异常血脂,由于历史上红曲产品具有可直接食用的特性,因此含Monacolin K的红曲产品更为消费者接受和喜爱。三十年多来,已经发现紫色红曲菌（Monascus purpureus）、发白红曲菌（M. albidus）、丛毛红曲菌（M. pilosus）等可产生Monacolin K,但不同菌种产Monacolin K的性能不同。在长期的研究或生产过程中菌种由于不断的移接传代,而导致生产性能的退化,且与土曲霉发酵产Lovstatin的产率相比,红曲菌Monacolin K产率较低,因此需要持续不断地进行菌种选育获得高产Monacolin K的红曲菌株。为了解红曲菌基因组中Monacolin K合成相关基因,为红曲菌遗传改造奠定基础,并找出更为简便的高产Monacolin K红曲菌种的筛选方法,将分子克隆与原生质体融合育种技术相结合也许是一条可行的途径。本课题的目的是建立根癌农杆菌介导转化红曲菌的方法,将携带遗传标记的T-DNA插入红曲菌基因组中,改变红曲菌遗传信息的排列,影响其生长和代谢,筛选高产Monacolin K突变转化子;从高产Monacolin K红曲菌突变株基因组中,根据已知的T-DNA两端保守序列,扩增出T-DNA插入位点侧翼序列,从而寻找影响Monacolin K合成的带T-DNA标签的突变基因,为研究红曲菌Monacolin K合成功能基因组及代谢调控提供基础信息;通过原生质体融合的方式选育红曲菌Monacolin K高产株并研究适合于遗传改造变异株高产Monacolin K的发酵工艺,为红曲菌工业化生产Monacolin K打下基础。主要研究结果如下:（1）构建了含有gpdA启动子、潮霉素抗性基因hph和trpC终止子的双元载体pCAMBIA 3300-gpdA-hph-trpC并转入根癌农杆菌GV3101;利用根癌农杆菌介导转化技术成功将潮霉素抗性基因转入发白红曲菌（M. albidus）9901,实验优化了抗生素浓度,发白红曲菌孢子浓度,根癌农杆菌细胞密度,共培养温度和时间,以及乙酰丁香酮浓度等转化条件,最终转化效率可达520个转化子/106个红曲孢子。对转化子进行潮霉素抗性基因PCR鉴定,结果进一步证实外源T-DNA已整合至转化子的染色体基因组中。在诸多转化子中,通过发酵实验筛选得到了一株比出发菌株发白红曲菌9901高产Monacolin K的T-DNA插入突变转化子H1。采用反向PCR方法对发白红曲菌转化子H1基因组T-DNA插入位点侧翼序列进行克隆,获得了一段0.88 kb的DNA片段,暂命名为mkWL,对DNA片段mkWL进行测序,通过与NCBI公布的丛毛红曲菌Monacolin K合成基因簇比对分析,发现与其中mkH基因（1.46 kb）部分基因序列同源性为97%。由此推断基因mkWL包含发白红曲菌Monacolin K合成关联基因。（2）对烟色红曲菌（M. fumeus） 9908和发白红曲菌转化子H1原生质体制备与再生的条件进行研究,考察了菌龄、渗透压稳定剂、裂解酶组合、酶解时间和再生培养基等条件对这两株红曲菌原生质体制备和再生的影响。将携带潮霉素抗性的转化子H1的原生质体灭活后,与烟色红曲菌9908原生质体融合,以潮霉素抗性作为筛选标记,得到了多株融合子,并对融合子固态发酵产Monacolin K能力进行考察,筛选得到了固态发酵高产Monacolin K的红曲菌融合子HH1,此菌株Monacolin K的产量较亲本烟色红曲菌9908和转化子H1分别提高了404%和27%。（3）对影响融合子HH1固态发酵产Monacolin K的因素进行了单因素考察,根据优化得到的发酵条件,融合子HH1以小米为原料固态发酵20 d后,Monacolin K的产量可达17.50 mg/g。采用Box-Behnken响应面分析法,进一步研究了拌料水加量、拌料水pH和接种量这三个因素对Monacolin K产量的影响,并建立了模型,模型预测的理论值与实验所得的实际值无显著性差异,说明此模型能够较好的模拟发酵实验。本研究克隆得到了发白红曲菌Monacolin K合成相关基因的DNA片段mkWL,并采用根癌农杆菌介导转化和原生质体融合技术筛选到红曲菌Monacolin K高产株,为发白红曲菌基因遗传改造及Monacolin K工业化生产奠定良好基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 红曲菌生物学特性
• 1.2 红曲菌代谢产物的研究
• 1.2.1 Monacolin K
• 1.2.2 红曲色素
• 1.2.3 桔霉素
• 1.3 提高红曲中Monacolin K 含量的研究
• 1.3.1 高产Monacolin K 红曲菌的选育
• 1.3.2 红曲菌发酵产Monacolin K 条件的优化
• 1.4 红曲菌遗传代谢的研究
• 1.4.1 基因组DNA、RNA 及mRNA 提取方法的研究
• 1.4.2 红曲菌基因组文库的构建
• 1.4.3 红曲菌遗传转化方法的研究
• 1.4.4 根癌农杆菌介导转化丝状真菌的研究
• 1.4.5 红曲菌主要代谢产物功能基因的研究
• 1.5 立题目的与意义
• 1.6 研究内容
• 1.7 论文总体策划
• 第二章 根癌农杆菌介导转化构建红曲菌潮霉素抗性株
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株和质粒
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 培养基
• 2.2.5 试剂配制
• 2.2.6 大肠杆菌重组DNA 基本技术
• 2.2.7 根癌农杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.2.8 根癌农杆菌介导转化红曲菌步骤
• 2.2.9 红曲菌转化子全DNA 的提取
• 2.2.10 引物设计及PCR 扩增条件
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 双元载体pCAMBIA 3300-gpdA-hph-trpC 的构建
• 2.3.2 双元载体导入根癌农杆菌GV3101
• 2.3.3 根癌农杆菌GV3101 介导转化发白红曲菌9901
• 2.4 本章小结
• 第三章 红曲菌转化子筛选及插入T-DNA 夹带序列测序分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 试剂
• 3.2.3 仪器
• 3.2.4 培养基和培养条件
• 3.2.5 Monacolin K 含量的测定
• 3.2.6 桔霉素的检测
• 3.2.7 大肠杆菌重组DNA 基本技术
• 3.2.8 反向PCR 克隆转化子T-DNA 插入侧翼序列
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 T-DNA 插入红曲菌突变转化子发酵性能的变化
• 3.3.2 T-DNA 插入红曲菌突变子菌落形态特征
• 3.3.3 反向PCR 克隆T-DNA 插入位点侧翼序列
• 3.3.4 T-DNA 插入位点序列分析比对
• 3.3.5 T-DNA 插入红曲菌突变子库的构建
• 3.4 本章小结
• 第四章 种间单亲灭活原生质体融合法选育Monacolin K 高产株
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 试剂与仪器
• 4.2.4 原生质体融合的步骤
• 4.2.5 融合重组体分子鉴定
• 4.2.6 融合子发酵性能的检测
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 渗透压稳定剂对红曲菌原生质体保持和再生的作用
• 4.3.2 新生菌丝有利于原生质体的释放和再生
• 4.3.3 破壁条件对红曲菌原生质体制备和再生的影响
• 4.3.4 不同再生培养基上红曲菌原生质体的再生率
• 4.3.5 原生质体显微形态观察
• 4.3.6 重组红曲菌热灭活条件的研究
• 4.3.7 以新建标记潮霉素筛选融合子
• 4.3.8 融合子Monacolin K 生成能力的考察
• 4.3.9 融合子的菌落形态
• 4.3.10 红曲菌融合子PCR 验证
• 4.3.11 红曲菌融合子稳定性的研究
• 4.4 本章小结
• 第五章 固态发酵优化提高红曲菌融合子Monacolin K 产率
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株
• 5.2.2 试剂
• 5.2.3 主要仪器
• 5.2.4 培养基及培养方法
• 5.2.5 发酵产物中Monacolin K 和桔霉素的检测
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 外加氮源对融合子Monacolin K 合成的影响
• 5.3.2 小米装料量对融合子产Monacolin K 的影响
• 5.3.3 料液比对融合子生长状态与Monacolin K 合成的作用
• 5.3.4 拌料水条件与Monacolin K 合成的关系
• 5.3.5 无机盐影响Monacolin K 合成的分析
• 5.3.6 接种量影响红曲菌融合子的生长及Monacolin K 代谢
• 5.3.7 Monacolin K 产量随发酵时间的变化曲线
• 5.3.8 红曲菌融合子固态发酵产Monacolin K 响应面法分析
• 5.3.9 固态发酵红曲米中桔霉素的检测
• 5.4 本章小结
• 主要结论与展望
• 主要结论
• 展望
• 论文创新点
• 致谢
• 专业术语中英文缩略对照表
• 参考文献
• 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文