西唐氏链霉菌Z-L-22活性物质的分离提纯及理化性质初探

论文摘要

番茄溃疡病（Bacteria Canker of Tomato）是由密执安棒杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subp．michiganensis，Cmm）引起的一种重要的细菌病害，每年造成严重的经济损失，目前还没有安全有效的防治措施。本实验室从番茄植株根际土中筛选出一株对番茄溃疡病菌有强烈颉颃作用的链霉菌，通过生物学鉴定和分子检测把其确定为西唐氏链霉菌（S．setonii）。本实验主要从西唐氏链霉菌Z-L-22发酵抑菌活性物质的稳定性、理化性质、分离提纯方法等几个方面进行研究。在分离提纯之前，首先对其进行预处理，结果表明经过草酸处理的发酵抑菌活性物质会有少量损失，但能提高发酵液萃取分离效率。用HCl和NaOH调无菌发酵上清液的pH值，并在室温处理24h，60℃、90℃度条件下处理1h，结果表明抑菌活性物质的在强酸和中性条件下比较稳定，强碱条件下稳定性降低，并且温度升高会使其在酸碱中的稳定性降低；经过不同的温度处理，120℃处理12h其抑菌圈直径依然能达到21.4mm，说明该活性物质的高温稳定性比较高；抑菌活性物质的紫外线和日光稳定性实验表明它对紫外线和日光有较强的稳定性。用捷克八溶剂系统纸层析和pH纸层析法对西唐氏链霉菌Z-L-22的抑菌活性物质进行分析，发现活性物质在捷克八溶剂系统中的Rf值都在0.9以上，与经典的抗生素素色谱图对比发现其与大环内酯类抗生素的色谱图类似；在不同的pH条件下抑菌活性物质纸层析的Rf值相近，都接近溶剂前沿，这与中性抗生素的pH纸层析的色谱图相似，综上所述把西唐氏链霉菌Z-L-22的发酵活性物质初步确定为中性的大环内酯类抗生素。用不同的展开剂对发酵粗提物进行TLC分析，发现苯：乙酸乙酯：甲醇=19：19：4为最佳展开剂，能把发酵粗提物分为8个组分，通过TLC制备各个组分并对其进行抑菌生物活性测定，发现其中的四个具有抑菌生物活性，为别为Ⅰ（Rf=0.96）、Ⅱ（Rf=0.64）、Ⅲ（Rf=0.56）、Ⅳ（Rf=0.5）。对乙酸乙酯发酵液萃取和丙酮菌丝浸提粗提物进行HPLC分析，发现两者的组分相同，只是组分的含量不同。TLC分离的组分Ⅱ的纯度为85.58％，组分Ⅲ的纯度为78.65％。用非极性大孔吸附树脂吸附发酵粗提物中的活性物质，用40％、70％、90％的乙醇进行梯度洗脱，梯度洗脱组分的HPLC分析表明70％乙醇洗脱得到一个纯度为50.05％的活性组分，90％洗脱得到一个纯度为66.08％的活性组分。最后用半制备HPLC对发酵粗提物进行分离提纯，得到纯度在组分97％以上的Ⅱ、Ⅲ组分。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 农用抗生素研究进展
• 1.2 农用抗生素的分离提纯
• 1.3 番茄溃疡病的研究进展
• 1.4 本实验研究目的、意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 供试培养基
• 2.1.3 供试仪器
• 2.1.4 试剂和材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 发酵液制备
• 2.2.2 抑菌活性物质的稳定性分析
• 2.2.3 抑菌活性物质理化性质确定
• 2.2.4 抑菌活性物质的分离提纯
• 2.2.5 抑菌活性物质的效价分析
• 3 结果分析
• 3.1 预处理对抑菌活性物质分配的影响
• 3.2 抑菌活性物质的稳定性分析
• 3.2.1 抑菌活性物质保存条件探索结果
• 3.2.2 抑菌活性物质热稳性分析结果
• 3.2.3 120℃抑菌活性物质稳定性分析结果
• 3.2.4 抑菌活性物质酸碱稳定性分析结果
• 3.2.5 抑菌活性物质的UV稳定性分析结果
• 3.2.6 抑菌活性物质的日光稳定性分析结果
• 3.3 抑菌活性物质的离子特性分析
• 3.3.1 抑菌活性物质捷克八溶剂系统纸层析分析
• 3.3.2 抑菌活性物质pH纸层析分析
• 3.3.3 抑菌活性物质TLC分析
• 3.3.4 抑菌活性物质TLC分离提纯结果
• 3.4 抑菌活性物质的分离提纯
• 3.4.1 抑菌活性物质的HPLC分析结果
• 3.4.2 TLC分离提纯活性组分的HPLC分析
• 3.4.3 抑菌活性物质的强碱性聚苯乙烯201×7型阴离子树脂的分离提纯结果
• 3.4.4 非极性大孔吸附树脂HZ803分离提纯结果
• 3.4.5 HPLC分离提纯结果
• 3.5 抑菌活性物质的效价分析结果
• 4 讨论
• 4.1 关于发酵液的预处理
• 4.2 关于抗生素的稳定性分析
• 4.3 关于抗生素的类型分析
• 4.4 关于抗生素的分离提纯
• 4.5 关于大环内酯类抗生素
• 4.6 本实验存在问题及下一步研究方向
• 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢