论文题目: 禽流感病毒ELISA快速检测试剂盒的研制及其重组核蛋白粘膜免疫研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 动物遗传育种与繁殖
作者: 肖运才
导师: 毕丁仁,熊远著
关键词: 禽流感病毒,酶联免疫吸附试验,诊断试剂盒,核蛋白蛋白,霍乱毒素亚基,粘膜免疫
文献来源: 华中农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 禽流感(AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。自1878年意大利首先发现至今,世界各地都有特定毒株引起的禽流感爆发和流行,导致禽类的大量死亡和生产性能的急剧下降,造成了巨大的经济损失。目前,高致病性禽流感(HPAI)是国际兽疫局规定的A类动物传染病。近年来,禽流感的发生与流行,在我国已造成了巨大的经济损失和严重的社会影响,尤其是香港1997年和东南亚2003-2004年出现的禽流感病毒(AIV)直接感染并致死人的事件,已引了世人的震惊和关注。其防制已直接关系到我国养禽业的持续稳定发展和人民的身体健康。本研究主要是建立一种快速的检测禽流感病毒抗原的ELISA方法,弥补其它检测方法的不足,为该病的早期诊断提供可靠依据和技术保证;另外,由于禽流感病毒亚型之多,不同亚型之间无交叉保护作用,给该病的防制带来了极大的困难,鉴于此,本研究试图利用霍乱毒素B亚基(Cholera toxin B subunit, CTB)强有力的粘膜免疫佐剂作用,将禽流感病毒型特异性NP基因的表达产物与CTB混合或与CTB融合表达后,制成疫苗通过鼻腔粘膜免疫鸡,以期提高鸡体鼻腔、气管粘膜表面sIgA的含量,从而达到预防和控制禽流感的目的。主要研究工作和结果如下: 1.鸡抗AIV、兔抗AIV和山羊抗兔IgG高免血清的制备及山羊抗兔IgG的HRP标记 将H9N2亚型的AIV经9-11日龄鸡胚传代后,收获鸡胚尿囊液,经30,000r/m离心1h后,AIV沉淀用原尿囊液1/30倍体积的0.01mol/L,pH7.2的PBS重悬,所得悬液与福氏佐剂乳化后免疫鸡和兔,得到鸡抗AIV和兔抗AIV的高免血清,其琼扩效价均达到1:64;同时,以纯化的兔IgG免疫山羊,将获得的山羊抗兔IgG高免血清(1:64)纯化后,经辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG,制备出特异性强、免疫学活性和催化活性高的山羊抗兔IgG-HKP,且工作浓度高达1:4000,为禽流感的夹心ELISA诊断方法的建立奠定了坚实的物质基础。 2.检测禽流感病毒的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法的建立 以纯化的鸡抗AIV IgG为包被抗体,兔抗AIV IgG为第二抗体,通过ELISA反应条件的优化选择,建立了检测AIV抗原的夹心ELISA法。结果表明,鸡抗AIV IgG的最佳包被浓度为1μg/mL,兔抗AIV IgG的最适工作浓度为5μg/mL;对已知的阳性样品,用夹心ELISA法测得的病毒滴度比血球凝集滴度高16倍以上,且能检出其它亚型的禽流感病毒;与新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、鸡痘病毒、马立克氏病病毒等无交叉反应,说明该方法有很高的特异性和敏感性。对14个鸡场送检的患有呼吸道疾病或有腹膜炎、眼炎、产蛋下降、怀疑为禽流感感染的病鸡进行了检测,结果有7个鸡场为阳性。
论文目录:
论文摘要
Abstract
英文缩略词表
第1章 文献综述
1．1 禽流感的研究进展
1．1．1 禽流感的发现、分布及其危害
1．1．1．1 禽流感的发现
1．1．1．2 禽流感在世界的分布及其危害
1．1．1．3 禽流感在我国的分布与危害
1．1．2 禽流感的病原学特征
1．1．2．1 禽流感的分类、命名及其进化
1．1．2．2 禽流感病毒的形态结构
1．1．2．3 禽流感病毒的理化特性
1．1．2．4 禽流感病毒的实验室宿主系统
1．1．3 禽流感病毒的分子生物学研究进展
1．1．3．1 病毒基因组结构及表达产物的功能
1．1．3．2 AIV的复制
1．1．3．3 流感病毒的遗传变异
1．1．4 禽流感的流行病学特征
1．1．4．1 易感动物
1．1．4．2 传染途径
1．1．4．3 潜伏期
1．1．4．4 流行季节
1．1．4．5 发病率和死亡率
1．1．5 禽流感的临床症状及其病理变化
1．1．5．1 临床症状
1．1．5．2 病理变化
1．1．6 禽流感病毒的免疫学
1．1．6．1 体液免疫
1．1．6．2 细胞免疫
1．1．7 禽流感检测方法研究进展
1．1．7．1 病毒的分离鉴定
1．1．7．2 血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验
1．1．7．3 神经氨酸酶抑制试验(NIT)
1．1．7．4 琼脂凝胶扩散试验(AGID)
1．1．7．5 病毒中和试验(NT)
1．1．7．6 免疫荧光技术(IFT)
1．1．7．7 酶联免疫吸附试验(ELISA)
1．1．7．8 分子生物学诊断技术
1．1．8 禽流感的防治
1．1．8．1 禽流感的疫苗研究进展
1．1．8．2 禽流感的综合防制
1．1．9 禽流感的公共卫生意义
1．2 粘膜免疫佐剂研究进展
1．2．1 霍乱毒素(CT)及其 B亚基(CTB)粘膜免疫佐剂研究进展
1．2．2 其它粘膜佐剂研究进展
1．2．2．1 大肠杆菌热敏肠毒素(LT)及其 B亚基(LTB)
1．2．2．2 免疫刺激复合物(Immunostimulating complexes，ISCOMs)
1．2．2．3 百日咳毒素(pertusis toxin，PT)
1．2．2．4 胞壁酰二肽(muramyl depeptide，MDP)及其衍生物
1．2．2．5 细菌脂多糖—(Lipopolysaccharide，LPS)
1．2．2．6 博氏疏螺旋体外表蛋白A(Outer surface protein A，OsPA)
1．2．3 粘膜免疫佐剂应用前景
第2章 鸡抗AIV、兔抗 AIV和山羊抗兔 IgG高免血清的制备及山羊抗兔 IgG的HRP标记
2．1 研究的目的和意义
2．2 材料与方法
2．2．1 材料
2．2．1．1 禽流感病毒(AIV)
2．2．1．2 标准 AIV的琼脂扩散(AGID)抗原和抗体
2．2．1．3 兔血清
2．2．1．4 SPF鸡胚及实验动物
2．2．1．5 主要试剂
2．2．1．6 主要溶液的配制
2．2．2 方法
2．2．2．1 禽流感病毒的增殖与纯化(浓缩)
2．2．2．2 健康兔血清 IgG的粗提及纯化
2．2．2．3 粗提兔血清 IgG的纯化
2．2．2．4 免疫原的乳化
2．2．2．5 鸡的免疫
2．2．2．6 家兔的免疫
2．2．2．7 山羊的免疫
2．2．2．8 鸡抗AIV IgG、兔抗AIV IgG和山羊抗兔 IgG的粗提与纯化
2．2．2．9 山羊抗兔 IgG-HRP的标记
2．2．2．10 山羊抗兔 IgG-HRP标记物的纯化
2．2．2．11 山羊抗兔IgG-HRP标记物的质量鉴定
2．2．2．12 与同类产品的比较
2．3 结果与分析
2．3．1 禽流感病毒的增殖与纯化(浓缩)
2．3．2 纯化后兔 IgG的浓度
2．3．3 血清抗体水平及纯化后的浓度
2．3．3．1 鸡抗AIV血清抗体水平及纯化后的浓度
2．3．3．2 兔抗 AIV血清抗体水平及纯化后的浓度
2．3．3．3 山羊抗兔 IgG血清抗体水平及纯化后的浓度
2．3．4 山羊抗兔 IgG-HRp结合物的纯化
2．3．4．1 G-200纯化山羊抗兔 IgG-HRP标记物
2．3．4．2 ELISA纯化山羊抗兔 IgG-HRP标记物
2．3．5 羊抗兔 IgG-HRP的质量鉴定
2．3．5．1 HRP/IgG mol数比值
2．3．5．2 山羊抗兔 IgG-HRP效价测定
2．3．6 与同类产品的比较
2．4 讨论
2．4．1 抗原
2．4．2 关于免疫程序
2．4．3 关于羊抗兔IgG-HRP结合物的提纯
2．4．4 山羊抗兔 IgG-HRP结合物的质量鉴定
2．5 小结
第3章 禽流感病毒 ELISA检测方法的建立
3．1 研究目的和意义
3．2 材料与方法
3．2．1 材料
3．2．1．1 病毒及微生物材料
3．2．1．2 主要试剂
3．2．1．3 ELISA试剂的配制
3．2．1．4 主要实验器材
3．2．2 方法
3．2．2．1 夹心 ELISA测定的基本实验步骤
3．2．2．2 包被抗体(Ab_1)和第二抗体(Ab_2)最佳工作浓度测定
3．2．2．3 敏感性试验及临界点的确定(设3个重复)
3．2．2．4 特异性试验
3．2．2．5 临床病鸡禽流感夹心 ELISA检测
3．3 结果与分析
3．3．1 ELISA最佳包被抗体(Ab_2)和兔抗AIV抗体(Ab_1)最佳工作浓度测定结果
3．3．2 已知AIV阳性尿囊液夹心 ELISA的效价测定(敏感性试验)
3．3．3 健康鸡群的检测
3．3．4 其它禽类病毒交叉性试验
3．3．5 特异性阻断试验
3．3．6 重复性试验结果
3．3．7 临床病鸡禽流感夹心 ELISA检测结果
3．4 讨论
3．4．1 夹心 ELISA最佳抗体(鸡抗 AIV IgG, Ab_1)包被浓度和兔抗AIV IgG(Ab_2)最佳工作浓度的选择
3．4．2 夹心ELISA的初步应用
3．5 小结
第4章 禽流感病毒夹心 ELISA诊断试剂盒的研制与应用
4．1 研究目的及意义
4．2 材料与方法
4．2．1 材料
4．2．1．1 试剂盒外包装
4．2．1．2 试剂盒内组份
4．2．2 方法
4．2．2．1 试剂盒内各组份的制备及质量控制
4．2．2．2 试剂盒的操作步骤及结果判定
4．2．2．3 试剂盒保存期试验
4．2．2．4 试剂盒的特异性、重复性及敏感性试验
4．2．2．5 试剂盒的推广应用结果
4．3 结果与分析
4．3．1 试剂盒的稳定性及保存期试验
4．3．2 不同批次试剂盒的检测差异结果
4．3．3 试剂盒的特异性、敏感性及重复性结果
4．3．4 试剂盒的推广应用结果
4．3．5 鸡禽流感的检测
4．3．6 大雁鹅禽流感感染的检测和诊断
4．3．7 鸭禽流感的检测
4．4 讨论
4．5 小结
第5章 禽流感病毒核蛋白(NP)基因与霍乱毒素 B亚单位(CTB)基因的融合表达研究
5．1 研究目的及意义
5．2 材料与方法
5．2．1 材料
5．2．1．1 质粒与菌株
5．2．1．2 培养基
5．2．1．3 酶、Marker及试剂盒
5．2．1．4 CTB引物
5．2．1．5 主要试剂及溶液的配置
5．2．2 方法
5．2．2．1 CTB片段的 PCR扩增
5．2．2．2 CTB-PCR产物的电泳检测
5．2．2．3 DNA片段的回收与纯化
5．2．2．4 PCR产物的克隆
5．2．2．5 大肠杆菌 DH5α、BL21(codon plus)感受态的制备
5．2．2．6 细菌的转化
5．2．2．7 碱裂解法小量制备质粒 DNA
5．2．2．8 重组质粒的酶切鉴定
5．2．2．9 原核表达载体的构建
5．2．2．10 重组质粒的诱导表达
5．2．2．11 SDS-PAGE
5．2．2．12 GST-CTB-NP的Western-blot分析
5．2．2．13 包涵体的制备
5．2．2．14 包涵体的纯化与复性
5．3 结果与分析
5．3．1 CTB片段的扩增
5．3．2 CTB基因的克隆、鉴定、测序及分析
5．3．3 重组表达质粒pGEX-KG-CTB的酶切鉴定
5．3．4 重组表达质粒pGEX-KGCN的酶切鉴定
5．3．5 表达产物的 SDS-PAGE结果
5．3．5．1 重组蛋白GST-CTB表达产物的 SDS-PAGE结果
5．3．5．2 重组蛋白GST-CTB-NP表达产物的 SDS-PAGE结果
5．3．6 重组蛋白GST-CTB-NP表达产物的Western-blot检测结果
5．3．7 包涵体的提取及检测结果
5．3．7．1 重组蛋白GST-CTB-NP包涵体的提取及检测结果
5．3．7．2 重组蛋白GST-CTB包涵体的提取及检测结果
5．4 讨论
5．4．1 CTB基因的克隆
5．4．2 CTB基因和 CTB-NP融合基因原核表达载体的构建
5．4．3 CTB蛋白和 CTB-NP融合蛋白的表达及包涵体的提取及纯化
5．5 小结
第6章 霍乱毒素 B亚单位、禽流感病毒重组核蛋白粘膜免疫研究
6．1 研究目的及意义
6．2 材料与方法
6．2．1 材料
6．2．1．1 试验动物
6．2．1．2 主要试剂
6．2．1．3 主要溶液的配制
6．2．2 方法
6．2．2．1 动物的免疫
6．2．2．2 样品的收集
6．2．2．3 样本的 ELISA检测
6．2．2．4 数据处理
6．3 结果与分析
6．3．1 免疫前后鼻腔洗液、气管洗液、肠腔洗液中sIgA-NP的 ELISA检测结果
6．3．2 免疫前后血清 IgG-NP、IgA-NP的 ELISA检测结果
6．4 讨论
6．4．1 关于粘膜免疫
6．4．2 我国禽流感的现状与防制
6．4．3 关于粘膜疫苗品质评定及其意义
6．5 小结
参考文献
致谢
发布时间: 2005-12-05
参考文献
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