论文摘要
肝癌是我国常见的严重危害人类生命的恶性肿瘤之一,发病率在我国的恶性肿瘤中居第二位。其中,肝细胞性肝癌（hepatocellularcarcinoma,HCc）是最主要的组织类型。探讨HCC组织中异常表达基因的分子生物学机制,对于了解其发生、发展过程以及辅助诊断和治疗,有着重要的理论和实际意义。Gadd45基因家族是在研究肿瘤发生,发展以及转归过程中新发现的相关基因家族,该家族成员主要包括Gadd45a、Gadd45p及Gadd45y。现有资料表明,该基因家族在细胞周期调控过程中发挥重要作用,但其对人肝癌细胞HepG2细胞周期的影响及具体机制尚不清楚,故此,本研究就Gadd45α/γ在HCC组织中的表达及Gadd45α抑制肝癌细胞生长的信号通路进行了初步探讨。第一部分Gadd45α/γ在肝癌组织中的表达及对人肝癌细胞HepG2细胞周期的影响目的:检测Gadd45α/γ蛋白在肝癌组织中的表达情况,并探讨其对人肝癌细胞HepG2细胞周期的影响。方法:随机选取临床HCC标本50例,运用免疫组织化学方法检测Gadd45α/γ蛋白在50例肝细胞性肝癌及癌旁组织中的表达水平并分析相关临床意义;体外培养人肝癌HepG2细胞,分别转染质粒pCMV-tag2B、pCMV-tag2B-Gadd45a和pCMV-tag2B-Gadd45γ,运用流式细胞仪检测Gadd45α/γ对细胞周期分布的影响。结果:（1）Gadd45a蛋白在50例肝细胞性肝癌中阳性率为58.0%（29/50）,癌旁组织中阳性率为62.0%（31/50）,两者差异没有统计学意义;Gadd45γ蛋白在肝癌组织中的阳性表达率为30.0%（15/50）,而在癌旁组织中的阳性表达率为86.0%（43/50）,两者比较有显著性差异（p＜0.01）。（2）Gadd45α/γ蛋白表达阳性率与肝癌分化程度有关,它们在高分化癌中阳性率（84.2%,57.9%）显著高于在中低分化癌中的阳性率（41.9%,12.9%）;两者有显著性差异（p＜0.05）,而Gadd45α/γ蛋白表达阳性率与性别,年龄以及淋巴结转移的相关性不明显（p＞0.05）。（3）将质粒pCMV-tag2B-Gadd45α/γ分别转染至人肝癌细胞HepG2后可诱导细胞周期G2/M期阻滞,且pCMV-tag2B-Gadd45α（G2/M期细胞比值为0.31±0.03）诱导的阻滞程度较pCMV-tag2B-Gadd45γ（G2/M期细胞比值为0.21±0.03）诱导的阻滞程度更为明显。结论:Gadd45α/γ蛋白的表达可能与肝癌的病理分型、发展以及转归过程存在着密切关系,与Gadd45γ相比,Gadd45α在肝癌的转归过程中可能扮演着更为重要的角色,并且为肝癌的基因治疗提供了新的分子靶点。第二部分Gadd45a诱导人肝癌细胞G2/M期阻滞的相关信号转导通路研究目的:探讨Gadd45α抑制肝癌细胞生长可能涉及的信号转导通路,为研究肝癌细胞生长抑制性基因提供初步理论依据。方法:体外培养人肝癌细胞HepG2,分别转染质粒pCMY-tag2B-Gadd45α和pCMV-tag2B至细胞,采用western blot方法检测Gadd45α及其下游基因P38、p-P38、JNK和p-JNK的表达变化;然后,给予信号通路的抑制剂（sB203580和SP600125）分别特异性阻断P38和JNK的磷酸化,再运用流式细胞仪检测并比较各组细胞周期,进而分析Gadd45α诱导肝癌细胞HepG2阻滞在G2/M期可能涉及的信号通路。结果:（1）将质粒pCMV-tag2B-Gadd45α转染至人肝癌细胞HepG2 48h后,Gadd45α蛋白表达峰值为0.68±0.02,其下游基因P38（0.94±0.01）和JNK（0.77±0.04）的磷酸化水平与空白对照组（0.58±0.02,0.50±0.02）相比均明显升高。（2）运用特异性抑制剂使升高的P38和JNK磷酸化表达水平降低至0.56±0.02和0.53±0.03,达到空白对照组磷酸化水平（0.58±0.02,0.50±0.02）,但细胞仍表现为G2/M阻滞,阻滞程度较非抑制剂组明显减弱。结论:在HepG2细胞中过度表达Gadd45a蛋白可以激活Gadd45α-P38和Gadd45α-JNK信号转导通路;Gadd45α-P38和Gadd45α-JNK通路参与了Gadd45α诱导的肝癌细胞G2/M期阻滞。
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