干扰黄瓜花叶病毒（CMV）人工MicroRNAs的构建及其遗传转化

论文摘要

黄瓜花叶病毒（Cucumber Mosaic Virus, CMV）是一种世界性病害,寄主范围广、能够被蚜虫传播、防治十分困难。尽管防治CMV的方法有多种,其中药剂防治会增加成本并带来环境污染；疫苗因环境变化而表现不稳定：自然抗病育种周期长且效率低；因而利用基因工程进行种质资源创新成为控制CMV的重要手段。特别是双链RNAs介导的基因沉默为改良作物对CMV的抗性发挥重要作用,但仅仅对供体CMV株系具有抗性,且低温时抗性容易突破,限制了生产应用。而miRNAs介导的基因沉默不仅诱导目标病毒的抗性,且保持低温时抗性稳定性,并将目标片段最小化和降低病毒异源重组风险。本研究利用miRNAs基因沉默技术,以抗性突破株系CMV-AN的2b基因高度保守区域为靶标,以植物起源的miRNA319前体为骨架,进行人工miRNA319的构建,以期望诱导CMV的广谱抗性。本研究结果如下：1.利用抗性突变株系CMV-AN 2b基因的30bp保守序列为靶标,以植物miR319前体为骨架,通过引物融合技术和OverlapPCR技术,用靶序列替换miR319前体miRNA:miRNA*区的突出部分,成功获得了amiR319。2.在限制性酶切位点BamHI和HindⅢ处将amiR319导入含双T7启动子的原核载体pLITMUS28i,获得重组载体pLITMUS28i-amiR319,以pLITMUS28i-miR319作对照,导入大肠杆菌HT115（RNaseⅢ缺失）菌株中供研究离体条件下amiR319介导CMV的抗性。3.利用限制性酶切位点BamHI和NcoⅠ将amiR319与中间载体替换获得2×35S:amiR319:poly（A）片段,并将其导入植物双元表达载体pCAMBIA1300,获得重组载体PCAMBIA1300-amiR319,以pCAMBIA1300-miR319作对照,分别导入农杆菌LB4404,通过酶切验证2x35S：amiR319:poly（A）片段及对照片段均为正向插入。4.利用农杆菌介导的叶盘转化法,将重组载体pCAMBIA1300-amiR319、pCAMBIA1300-miR319转入到三生烟中,转基因烟草对CMV的抗性有待于进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstracts
• 第一章 文献综述
• 1 黄瓜花叶病毒概述
• 1.1 黄瓜花叶病毒的分类地位、病原形态及生物学
• 1.2 黄瓜花叶病毒的分布及危害症状
• 1.3 黄瓜花叶病毒的发生规律及传毒介体
• 2 黄瓜花叶病毒的防治
• 3 转录后基因沉默
• 3.1 转录后基因沉默的发现及定义
• 3.2 转录后基因沉默的分类和相关作用机制
• 3.3 RNA沉默的病毒抑制子
• 3.4 人工microRNA抗病研究进展
• 4 本研究的背景及技术路线
• 4.1 研究背景
• 4.2 技术路线
• 第二章 人工microRNA319的构建
• 1 材料
• 1.1 供试菌株和载体
• 1.2 供试试剂
• 1.3 引物
• 1.4 常用试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 DNA分子操作常规技术
• 2.2 人工microRNA319的构建示意图
• 3 结果与分析
• 3.1 人工microRNA319的构建
• 3.2 人工microRNA319测序结果
• 3.3 人工microRNA319电泳检测
• 4 讨论
• 第三章 amiRNA319原核表达载体的构建
• 1 材料
• 1.1 供试菌株和载体
• 1.2 供试试剂
• 1.3 引物
• 1.4 常用试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 DNA分子操作常规技术
• 2.2 amiR319原核表达载体的构建策略
• 2.3 miR319原核表达载体的构建策略
• 2.4 原核表达载体转大肠杆菌HT115（RNaseⅢ缺失）
• 3 结果与分析
• 3.1 amiR319原核表达载体构建过程
• 3.2 miR319原核表达载体构建过程
• 3.3 原核表达载体转大肠杆菌HT115（RNaseⅢ缺失）
• 4 讨论
• 第四章 amiRNA319双元表达载体的构建
• 1 材料
• 1.1 供试菌株和载体
• 1.2 供试试剂
• 1.3 引物
• 1.4 常用试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 DNA分子操作常规技术
• 2.2 amiRNA319双元表达载体的构建策略
• 2.3 miRNA319双元表达载体的构建策略
• 2.4 双元表达载体转化农杆菌LB4404
• 3 结果与分析
• 3.1 amiRNA319双元表达载体构建过程图
• 3.2 miRNA319双元表达载体构建过程图
• 3.3 双元表达载体转化农杆菌LB4404
• 4 讨论
• 第五章 双元表达载体在烟草中表达
• 1 材料
• 1.1 供试菌株和载体
• 1.2 植物材料
• 1.3 供试试剂
• 1.4 植物培养基
• 2 方法
• 2.1 用于转化的根癌农杆菌的准备
• 2.2 烟草遗传转化体系的建立
• 3 结果与分析
• 3.1 潮霉素临界值的筛选结果
• 3.2 转基因烟草再生苗的获得
• 4 讨论
• 第六章 结论和创新点
• 1 结论
• 2 创新点
• 参考文献
• 附录A 本论文所用重要缩写词及中文对照
• 附录B 常用缓冲液及培养基配方
• 附录C 常用的抗生素配制方法及使用浓度
• 附录D 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器
• 附录E amiRNA319序列测序比对结果
• 致谢
• 个人简历