小麦叶片中与Rubisco大亚基降解相关的蛋白酶的生化特性、合成定位及分离纯化研究

小麦叶片中与Rubisco大亚基降解相关的蛋白酶的生化特性、合成定位及分离纯化研究

论文摘要

本实验室研究发现,小麦叶片中存在着能够降解1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)大亚基(LSU)为51KDa的相关蛋白酶,而且该蛋白酶在其分离纯化过程中与Rubisco紧密结合。本文以小麦3E158(Triticum aestivum L.cv.3E158)和扬麦158(Triticum aestivum L. cv. Yangmai158)叶片为实验材料,通过天然梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(GPAGE)后切胶回收得到的Rubisco,应用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离Rubisco蛋白亚基及蛋白酶,分别采用SDS-PAGE、加明胶的活性SDS-PAGE鉴定蛋白质和检测蛋白酶的方式,研究了该蛋白酶的生化特性和合成的细胞定位,并对与Rubisco紧密结合的蛋白酶的分离纯化进行了进一步尝试。其主要研究结果简述如下:1、与Rubisco大亚基降解相关的蛋白酶的生化特性小麦粗酶提取液经过非变性梯度(5%-10%)聚丙烯酰胺凝胶电泳后,通过切胶方法回收含有Rubisco的凝胶,我们得到了纯度很高的Rubisco全酶。将这种Rubisco全酶在不同的温度下进行处理2h,发现降解LSU的蛋白酶的最适温度为40~50℃。研究不同浓度的ATP对Rubisco大亚基的降解影响,结果表明,在添加1mmol·L-1ATP下能加速LSU降解,并降解成很多小的片段;添加的ATP浓度过高或过低,LSU降解程度相对较弱。选取小麦初生叶(平均叶长2cm)为材料,切胶回收得到纯度很高的Rubisco全酶。将这种Rubisco全酶在40℃下保温处理6h后,通过SDS-PAGE检测,发现能够清晰的得到Rubisco大亚基被降解为51KDa的条带;同时,对上述样品煮沸5min,再进行适宜温度下保温反应6h,发现此时LSU不再发生降解。因此,我们认为,降解Rubisco大亚基为51KDa的相关蛋白酶在小麦叶片的生长初期即已存在。2、与Rubisco大亚基降解相关的蛋白酶合成的细胞定位选用两种蛋白质合成抑制剂—放线菌酮(核基因编码蛋白质合成抑制剂)和林可霉素(叶绿体基因编码蛋白质合成抑制剂),分别浸泡处理暗处的小麦叶片。不同浓度(0.01、0.1和lmg/ml)的上述抑制剂作用叶片后,提取叶片粗酶液,通过SDS-PAGE检测LSU的降解情况,结果显示,林可霉素抑制LSU降解作用更明显。此外,1mg/ml林可霉素的抑制作用更好。1mg/ml的两种抑制剂,单独及其混合溶液暗处浸泡处理叶片1d,然后在pH7.5的Tis-HCl缓冲体系和pH5.5的柠檬酸缓冲体系下,通过聚丙烯酰胺电泳及切胶回收得到相应缓冲体系下的Rubisco全酶,SDS-PAGE检测Rubisco降解为51KDa的情况。实验结果显示,在两种pH条件下,林可霉素均能较强地抑制蛋白酶对Rubisco大亚基的降解。此外,1mg/ml抑制剂暗处浸泡处理叶片不同的时间,结果发现,随着处理时间增加,林可霉素处理的Rubisco大亚基发生降解的情况越少。由此,我们可以确定,叶片暗诱导衰老过程中合成产生的特异性降解LSU的该蛋白酶可能主要是由叶绿体基因编码的。3、分离纯化结合Rubisco并降解大亚基的蛋白酶切胶回收得到的Rubisco样品,过mono-Q强阴离子交换柱,收集Rubisco峰进行脱盐,浓缩后SDS-PAGE检测。结果表明,Rubisco仍会降解,即Rubisco样品通过强阴离子交换柱分离依然没有将该蛋白酶和Rubisco分开。切胶回收得到的浓度很高的Rubisco酶液进行非完全变性(样液不进行加热煮沸)的SDS-PAGE,电泳后用TritionX-100脱去SDS。然后,分别切胶回收整块凝胶中Rubisco大亚基、小亚基所在处及分离胶中除大、小亚基位置之外的成分,最后分别将大亚基之外的其他各成分加入大亚基成分中,SDS凝胶电泳检测发现,Rubisco全酶经过SDS凝胶电泳后,降解Rubisco大亚基的蛋白酶能够与Rubisco大、小亚基分开,而这种蛋白酶可能不止一种,其中占主导地位的蛋白酶分子量可能比大亚基大。通过对切胶回收的Rubisco全酶进行添加明胶的SDS-PAGE活性电泳检测,也发现Rubisco切胶回收酶液中存在着一种分子量可能高于大亚基的蛋白酶。

论文目录

  • 目录
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词对照表
  • 前言
  • 文献综述
  • 一、Rubisco的研究进展
  • 1.1 Rubisco的结构
  • 1.2 Rubisco的组装及亚基的功能
  • 1.3 Rubisco酶的活化、催化及其调节作用
  • 二、植物体内的蛋白水解酶
  • 2.1 植物体内蛋白水解酶的类型
  • 2.2 植物体内蛋白水解酶的定位
  • 2.3 内肽酶的研究技术和方法
  • 三、Rubisco的降解及其与蛋白水解酶的关系
  • 3.1 Rubisco的降解与活性氧
  • 3.2 Rubisco的降解与蛋白水解酶
  • 3.2.1 降解Rubisco的蛋白水解酶
  • 3.2.2 蛋白水解酶降解Rubisco的途径
  • 第一章 与Rubisco大亚基降解相关的蛋白酶的生化特性
  • 1 材料与方法
  • 1.1 小麦品种及其培养
  • 1.2 仪器与试剂
  • 1.3 粗酶液提取
  • 1.4 蛋白质含量测定
  • 1.5 天然梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳
  • 1.6 电泳后切胶回收Rubisco
  • 1.7 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
  • 1.8 考马斯亮蓝R-250染色与脱色
  • 1.9 不同温度下,Rubisco大亚基的降解
  • 1.10 不同浓度的ATP对Rubisco大亚基降解的影响
  • 1.11 降解LSU为51KD的蛋白酶在时间上的表达特性
  • 1.11.1 幼嫩叶片中Rubisco的降解情况
  • 1.11.2 幼嫩叶中LSU降解作用是蛋白酶作用的检验
  • 1.12 其他小麦品种中Rubisco大亚基的降解情况
  • 2 结果与分析
  • 2.1 不同温度下切胶回收得到的Rubisco的降解情况
  • 2.2 不同浓度的ATP对Rubisco大亚基降解的影响
  • 2.3 降解LSU为51KD的蛋白酶在时间上的表达特性
  • 2.3.1 幼嫩叶片中Rubisco的降解情况
  • 2.3.2 幼嫩叶中LSU降解为51KD是蛋白酶作用的检验
  • 2.4 其他小麦品种中Rubisco大亚基的降解情况
  • 3 讨论
  • 第二章 与Rubisco大亚基降解相关的蛋白酶合成的细胞定位
  • 1 材料与方法
  • 1.1 小麦品种及其培养
  • 1.2 仪器与试剂
  • 1.3 抑制剂对小麦叶片进行处理
  • 1.4 粗酶液提取和蛋白含量测定
  • 1.5 天然梯度凝胶电泳
  • 1.6 电泳后切胶回收Rubisco
  • 1.7 SDS-PAGE
  • 1.8 考马斯亮蓝R-250染色法
  • 1.9 蛋白酶荧光底物检测蛋白酶活性
  • 1.10 不同浓度的两种抑制剂处理下Rubisco大亚基的降解情况
  • 1.11 pH7.5条件下不同抑制剂处理对该蛋白酶合成的抑制作用
  • 1.11.1 两种不同抑制剂其等量混合液处理下Rubisco大亚基的降解情况
  • 1.11.2 两种不同抑制剂及其等量混合液处理叶片中与Rubisco结合的蛋白酶活性荧光定量分析
  • 1.11.3 不同抑制剂处理暗处叶片不同时间后Rubisco大亚基的降解情况
  • 1.12 pH5.5条件下不同抑制剂处理对该蛋白酶合成的抑制作用
  • 1.12.1 两种不同抑制剂及其等量混合液处理叶片对Rubisco大亚基降解情况的影响
  • 1.12.2 两种不同抑制剂及其等量混合液处理作用下与Rubisco结合的蛋白酶的荧光定量分析
  • 2 结果与分析
  • 2.1 不同浓度的两种抑制剂下,Rubisco大亚基的降解情况
  • 2.2 pH7.5条件下,两种不同抑制剂对该蛋白酶合成的抑制作用
  • 2.2.1 两种不同抑制剂及其等量混合液处理下Rubisco大亚基的降解情况
  • 2.2.2 两种不同抑制剂及其等量混合液处理的叶片中与Rubisco结合的蛋白酶活性的荧光定量分析
  • 2.2.3 抑制剂暗处处理叶片不同时间后Rubisco大亚基的降解情况
  • 2.3 pH5.5条件下不同抑制剂对该蛋白酶合成的抑制作用
  • 2.3.1 两种不同抑制剂及其等量混合液处理下Rubisco大亚基的降解
  • 2.3.2 两种不同抑制剂及其等量混合液处理叶片中与Rubisco结合的蛋白酶蛋活性的荧光定量分析
  • 3 讨论
  • 第三章 分离纯化结合Rubisco并降解大亚基的蛋白酶
  • 1 材料与方法
  • 1.1 小麦品种及其培养
  • 1.2 仪器与试剂
  • 1.3 粗酶液提取和蛋白含量测定
  • 1.4 天然梯度凝胶电泳
  • 1.5 电泳后切胶回收Rubisco
  • 1.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳
  • 1.6.1 SDS-PAGE
  • 1.6.2 非完全变性SDS-PAGE
  • 1.6.3 Gel-SDS-PAGE
  • 1.7 蛋白及蛋白酶染色方法
  • 1.7.1 氨基黑染色法
  • 1.7.2 银染方法
  • 1.7.3 考马斯亮蓝R-250染色法
  • 1.8 强阴离子交换层析分离结合Rubisco且降解LSU的蛋白酶
  • 1.8.1 mono-Q强阴离子交换层析
  • 1.8.2 用SDS-PAGE法和荧光分光光度计法对主峰组份进行检测
  • 1.8.3 对强阴离子交换层析中其他它峰的组份进行检测
  • 1.9 非完全变性SDS-PAGE分离纯化结合Rubisco并降解大亚基的蛋白酶
  • 1.9.1 不同浓度的SDS对Rubisco大亚基降解的影响
  • 1.9.2 切胶回收大亚基所得样品的降解情况及其荧光测定
  • 1.9.3 Rubisco切胶回收酶液中小亚基及大小亚基之外的成分对大亚基降解的影响
  • 1.9.4 Rubisco切胶回收酶液进行SDS-PAGE时分离开的该蛋白酶在凝胶中的位置
  • 1.9.5 冬季时,切胶回收的Rubisco全酶样品中该蛋白酶的降解作用
  • 1.9.6 银染法检测切胶回收的Rubisco全酶样品中该蛋白酶的含量
  • 1.9.7 切胶回收的Rubisco全酶样品中蛋白酶活性的检测
  • 1.9.8 不同生长时期的小麦叶片中蛋白酶活性的检测
  • 2 结果与分析
  • 2.1 强阴离子交换层析分离结合Rubisco且降解LSU的蛋白酶
  • 2.1.1 Rubisco切胶回收样的mono-Q强阴离子交换层析
  • 2.1.2 用SDS-PAGE法和荧光分光光度计法对主峰组份进行检测
  • 2.1.3 对强阴离子交换层析中其它蛋白峰的成分进行检测
  • 2.2 非完全变性SDS-PAGE分离结合Rubisco且降解LSU的蛋白酶
  • 2.2.1 不同浓度的SDS对Rubisco大亚基降解的影响
  • 2.2.2 切胶回收大亚基所得样品的降解情况及其荧光测定
  • 2.2.3 Rubisco切胶回收酶液中小亚基及大小亚基之外的成分对大亚基降解的影响
  • 2.2.4 Rubisco切胶回收酶液进行SDS-PAGE时分离开的该蛋白酶在凝胶中的位置
  • 2.2.5 冬季时,切胶回收的Rubisco全酶样品中该蛋白酶的降解作用
  • 2.2.6 切胶回收的Rubisco全酶样品中蛋白酶活性的检测
  • 2.2.7 不同生长时期的叶片中紧密结合Rubisco且分子量比大亚基大的蛋白酶活性的检测
  • 3 讨论
  • 全文结论
  • 创新之处
  • 参考文献
  • 致谢
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