芍药甘草汤入血成分的研究

论文摘要

安全、有效和质量可控为现代药物的基本属性。一个药品能否为现代社会所认同,这三个属性缺一不可。要将传统中药开发成现代意义的药品必须解决中药药效物质基础问题。中药和人体是两个彼此独立的复杂系统,在相互作用的过程中,两个复杂系统之间是靠化学信息进行“对话”的。研究两者之间的化学信息流是解决两者之间作用规律的切入点,离开了相互作用就无从研究中药的药效物质基础,故选择中药经口服入血的成分为研究对象。本论文以芍药甘草汤为工具药,建立其体内分析方法,分离并鉴定其入血成分,为靶细胞或靶酶亲和结合入血成分研究其药效物质做准备,最终目的是要建立基于体内过程研究中药药效物质基础的方法。1.血中移行成分的分析及归属建立了芍药甘草汤化学成分的体内外HPLC分析方法。在此基础上比较分析芍药甘草汤提取液HPLC色谱图和血清样品HPLC色谱图,根据各成分保留时间确定进入血液的原型成分和代谢转化成分。通过组方的单味药提取液HPLC色谱图、芍药甘草汤提取液HPLC色谱图与大鼠口服芍药甘草汤后的血清样品HPLC色谱图进行比较分析,根据各成分保留时间确定入血原型成分的来源药材。研究表明芍药甘草汤给药后血清样品有32个血中移行成分（SGT1-SGT32）,其中17个为原方直接入血成分,15个为代谢产物。白芍杰煎液给药后血清样品有8个入血成分（S1-S8）,炙甘草水煎液给药后血清样品有22个血中移行成分（G1-G22）。复方血中移行成分SGT1、SGT2、SGT6、SGT7、SGT14、SGT16、SGT20、SGT26来源于白芍血中移行成分S1-S8,其中SGT1、SGT2、SGT6、SGT7、SGT14为白芍所含成分直接入血形成；复方入血成分SGT3、SGT4、SGT5、SGT8、SGT9、SGT10、SGT11、SGT13、SGT15、SGT17、SGT18、SGT19、SGT21、SGT22、SGT24、SGT25、SGT27、SGT28、SGT29、SGT30、SGT31、SGT32来源于炙甘草血中移行成分G1-G22,其中SGT3、SGT4、SGT8、SGT9、SGT10、SGT11、SGT15、SGT17、SGT18、SGT21、SGT25、SGT29为甘草所含成分直接入血形成；SGT12与SGT23为复方共煎给药后新出现的入血成分。其中SGT6、SGT7、SGT10、SGT11、SGT14、SGT15、SGT16、SGT17、SGT18、SGT24、SGT25、SGT26、SGT27、SGT28、SGT29、SGT32等成分在白芍和甘草伍用后血药浓度明显增加。白芍、甘草配伍后,两者生物利用度明显提高,说明两者存在相互协同的作用。研究结果与其它方法所得结论一致,证明血清HPLC指纹谱也可用于研究复方的配伍规律。2.血中移行成分的分离鉴定以芍药甘草汤HPLC血清指纹谱为指导,采用传统与现代制备色谱技术相结合的方法（大孔树脂、硅胶、反向硅胶、凝胶等柱色谱、制备HPLC）,从原药材提取物中分离芍药甘草汤中进入大鼠血中的原型成分。将白芍水煎液与芍药甘草汤给药后血清样品色谱图对照,确认了芍药甘草汤中SGT1、SGT2、SGT6、SGT7、SGT14号血中移行成分,结果从白芍中分离得到5个入血原型成分。借助ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR数据分别进行了结构鉴定：SGT1为没食子酸（gallic acid）、SGT2为异芍药苷（isopaeoniflorin）、SGT6为白芍苷（albiflorin）、SGT7为芍药苷（paeoniflorin）、SGT14为异苯甲酰芍药苷（isobenzoylpaeoniflorin）。将炙甘草水煎液与芍药甘草汤给药后血清样品色谱图对照,确认了芍药甘草汤中SGT8、SGT10、SGT11、SGT15、SGT17、SGT18、SGT21、SGT29号血中移行成分,结果从炙甘草中分离得到8个入血原型成分,借助ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR数据分别进行了结构鉴定：SGT8为异佛来心苷（isoviolanthin）、SGT10为甘草素-4’-O-芹糖基-（1→2）葡萄糖苷（4’-0-[β-D-apiofuranosyl（1→2）-β-D-glucopyranosyl] liquiritigenin）、SGT11为甘草苷（liquiritin）、SGT15为异甘草素-4-O-芹糖基-（1→2）葡萄糖苷（4-O-[β-D-apiofuranosyl（1→2）-β-D-glucopyranosyl] isoliquiritigenin）、SGT17为异芒柄花甙（isoononin）、SGT18为异甘草苷（isoliquiritin）、SGT21为甘草素（liquiritigenin）、SGT29为甘草酸（Glycyrrhizic acid）。以上研究表明芍药甘草汤入血原型成分与报道的芍药甘草汤的药效物质基础为芍药苷、甘草次酸一致,说明复方中的众多成分只有入血成分才可能是其药效成分。可见从中药复方的入血成分探讨其药效物质基础的方法是可行的。如果利用靶细胞或靶酶对入血成分进行亲和结合,将进一步确认复方的药效物质基础,以此建立与临床活性相关的体内真正药效物质基础的质量控制方法,为中药及其复方药效物质基础研究提供新的思路与方法,为中药复方的现代化研究提供思路和方法学的借鉴。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 芍药甘草汤的研究概况
• 1 组方配伍研究
• 1.1 古方研究组方配伍的合理性
• 1.2 药理学研究组方配伍的合理性
• 1.3 药代动力学研究组方配伍的合理性
• 1.4 指纹图谱研究组方配伍的合理性
• 2 药理作用
• 2.1 解痉作用
• 2.2 镇痛、镇静作用
• 2.3 抗炎作用
• 3 临床应用
• 4 小结
• 参考文献
• 第二章 中药药效物质基础的研究思路与方法概述
• 1 传统的植物化学研究方法
• 2 药代动力学对血清处理分析的研究方法
• 3 基于受体理论构建的生物色谱研究方法
• 3.1 分子生物色谱法
• 3.2 细胞膜色谱法
• 3.3 细胞萃取法
• 4 高通量筛选技术——亲和超滤技术研究方法
• 5 小结与展望
• 参考文献
• 第二部分 实验部分
• 第三章 芍药甘草汤血中移行成分的分析及归属研究
• 1 材料
• 1.1 仪器
• 1.2 试药
• 1.3 动物
• 2 方法与结果
• 2.1 色谱分析条件
• 2.2 供试液的制备
• 2.3 对照品溶液的制备
• 2.4 受试大鼠给药方案
• 2.5 血清样品的制备
• 2.6 色谱条件的选择及优化
• 2.6.1 流动相的组成优化
• 2.6.2 检测波长的选择
• 2.7 血清处理方法的考察
• 2.7.1 乙酸乙酯萃取法
• 2.7.2 70%高氯酸法
• 2.7.3 固相萃取法
• 2.7.4 甲醇沉淀法
• 2.8 给药方式及采血时间点考察
• 2.9 方法学考察
• 2.9.1 精密度实验
• 2.9.2 稳定性实验
• 2.9.3 重复性实验
• 2.10 血清HPLC指纹谱分析
• 3 小结
• 4 讨论
• 参考文献
• 第四章 芍药甘草汤入血成分的制备分离及结构鉴定
• 第一节 芍药甘草汤中源于白芍入血原型成分的分离和鉴定
• 1 实验仪器及材料
• 1.1 仪器
• 1.2 实验材料
• 2 方法与结果
• 2.1 提取与分离
• 2.2 化合物结构解析
• 2.2.1 化合物1（SGT1）的结构解析
• 2.2.2 化合物2（SGT2）的结构解析
• 2.2.3 化合物3（SGT6）的结构解析
• 2.2.4 化合物4（SGT7）的结构解析
• 2.2.5 化合物5（SGT14）的结构解析
• 3 小结
• 参考文献
• 第二节 芍药甘草汤中源于甘草入血原型成分的制备分离与鉴定
• 1 实验仪器及材料
• 1.1 仪器
• 1.2 实验材料
• 2 方法与结果
• 2.1 提取与分离
• 2.2 化合物结构解析
• 2.2.1 化合物7（SGT8）的结构解析
• 2.2.2 化合物9（SGT10）的结构解析
• 2.2.3 化合物10（SGT11）的结构解析
• 2.2.4 化合物11（SGT15）的结构解析
• 2.2.5 化合物12（SGT17）的结构解析
• 2.2.6 化合物13（SGT18）的结构解析
• 2.2.7 化合物14（SGT21）的结构解析
• 2.2.8 化合物15（SGT29）的结构解析
• 3 小结
• 参考文献
• 结语
• 附录
• 附图目录
• 攻读硕士学位期间取得的学术成果
• 致谢