肝癌细胞组蛋白H3乙酰化修饰定量及乙酰化分离富集新方法研究

论文摘要

本论文工作的主要贡献为：通过甲基化定量与LTQ-Orbitrap技术联用,对不同转移潜能肝癌细胞系的组蛋白H3乙酰化修饰位点进行定量分析,所得数据对于肝癌转移相关研究具有很高的价值；针对蛋白质乙酰化修饰富集中基于抗体的固定技术进行了研究,建立了基于微流控芯片的抗体固定技术富集乙酰化蛋白和肽段的完整路线,为乙酰化蛋白和肽段的富集鉴定开辟了一条新的途径。蛋白质的赖氨酸乙酰化修饰是一种动态的可变修饰,作为一种重要的翻译后修饰而被广泛研究。蛋白质乙酰化修饰对于DNA和蛋白质相互作用、DNA的转录活性、蛋白稳定性、蛋白质和蛋白质的相互作用、迁移和分化等蛋白质相关过程起着重要的调控作用。研究发现,糖酵解通路、糖异生通路、三羧酸循环通路、尿素循环通路等重要代谢通路中的酶都发生了乙酰化作用。乙酰化蛋白的含量很低,在鉴定中其信号会被大量的非乙酰化蛋白所抑制,这给其鉴定及功能研究带来了很大的挑战。目前,将乙酰化的富集技术与质谱的鉴定技术结合是乙酰化修饰研究中的主要方法,而利用抗赖氨酸乙酰化抗体进行乙酰化修饰的富集是主要的富集方法。另外,组蛋白是细胞核内一种高度保守的蛋白,它易发生多种翻译后修饰,在基因的表达,转录,损伤修复等过程中发挥重要作用。有文献报道,组蛋白H3的乙酰化水平在前列腺癌,乳腺癌,肺癌等疾病中具有很重要的临床诊断意义,但至今为止,国内外文献中尚未对肝癌中组蛋白H3乙酰化位点及水平进行过系统、详尽的研究报道。本论文的第一章首先就目前的蛋白质组学研究及翻译后修饰的研究进行了小结,然后介绍了乙酰化翻译后修饰的研究进展、微流控芯片在制作材料及分析应用等方面的研究进展,并强调了对微流控芯片通道表面进行改性和修饰的必要性和重要性；概述了肝癌及其转移的蛋白质组学研究进展,说明了本论文的选题目的和意义。本论文的第二章主要对肝癌细胞组蛋白H3乙酰化位点进行了定量研究。通过色谱分离,甲基化定量与LTQ-Orbitrap技术联用,对不同转移潜能肝癌细胞系的组蛋白H3乙酰化修饰位点进行定量分析,结果得到6个乙酰化及4个甲基化修饰肽段的定量信息。我们发现随着肝癌的发生和转移潜能的升高,鉴定到的6条乙酰化肽段及4条甲基化肽段的含量均发生了显著的下降,所得数据为肝癌的治疗和新药靶的研究提供了理论依据。本论文的第三章主要对基于微流控芯片的抗体固定技术进行了研究,并将其应用于乙酰化蛋白和肽段的分离富集中。我们首次将微流控芯片与Protein A/G定向化固定抗体的优势结合在一起,通过Protein A/G在自制的微流控芯片中固定乙酰化抗体,分别对混合蛋白中乙酰化的牛血清白蛋白（BSA-Ac）和BSA-Ac溶液酶解的乙酰化肽段进行富集,并用MALDI-MS对富集的乙酰化肽段进行鉴定。结果显示,基于微流控芯片的抗体的固定方向不是随机的,Protein A/G可以与抗体的Fc区域特异性的结合,使得抗体Fab区域与抗原蛋白充分结合,极大的提高了抗原的结合效率和特异性,对于乙酰化蛋白BSA-Ac的富集效率可以达到82.4%,并且可以很好的富集乙酰化肽段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 一、蛋白质组学中的翻译后修饰研究概述
• 1.1 蛋白质组学的基本概念
• 1.2 蛋白质组学中的翻译后修饰研究
• 二、乙酰化翻译后修饰研究进展
• 2.1 组蛋白的乙酰化研究
• 2.1.1 乙酰化转移酶和其抑制剂
• 2.1.2 去乙酰化转移酶和其抑制剂
• 2.2 非组蛋白的乙酰化研究
• 三、微流控芯片技术概述
• 3.1 微流控芯片基本概念
• 3.2 微流控芯片的材料及制作
• 3.2.1 微流控芯片的材料
• 3.2.2 微流控芯片的制作技术
• 3.3 微流控芯片的表面修饰
• 3.4 微流控芯片在生化分析中的应用
• 四、肝癌和肝癌转移研究概述
• 4.1 肝癌及肝癌转移的概念
• 4.2 肝癌及肝癌转移的蛋白质组学研究
• 五、本论文选题目的及意义
• 参考文献
• 第二章 肝癌细胞组蛋白H3乙酰化修饰的定量研究
• 一、研究背景
• 二、实验部分
• 2.1 试剂和材料
• 2.1.1 组蛋白提取
• 2.1.2 SDS-PAGE相关
• 2.1.3 免疫印记相关
• 2.1.4 甲基化定量相关
• 2.1.5 酶解和质谱相关
• 2.1.6 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 组蛋白提取
• 2.2.2 蛋白质含量测定
• 2.2.3 电泳及染色
• 2.2.4 免疫印迹
• 2.2.5 组蛋白H3分子量测定及组蛋白H3收集
• 2.2.6 组蛋白H3的溶液酶解和甲基化定量
• 2.2.7 标记肽段的分离与鉴定
• 2.2.8 数据检索
• 三、结果与讨论
• 3.1 293T细胞组蛋白H3的提取及鉴定
• 3.2 肝癌细胞株组蛋白H3的提取
• 3.3 组蛋白H3分子量测定及组蛋白H3收集
• 3.4 甲基化同位素标记在基于质谱的相对定量中的表现
• 3.5 甲基化同位素标记组蛋白在LC-LTQ-Orbitrap路线中的稳定性
• 3.6 五种细胞系组蛋白H3乙酰化位点的定量分析
• 3.6.1 肝细胞L02和肝癌细胞HepG2中组蛋白H3乙酰化位点定量
• 3.6.2 肝癌细胞HepG2和肝癌转移细胞97H中组蛋白H3乙酰化位点定量
• 3.6.3 不同转移潜能肝癌细胞系97L和LM3中组蛋白H3乙酰化位点定量
• 3.6.4 五种细胞系组蛋白H3乙酰化位点的定量结果对比分析
• 四、结论与展望
• 参考文献
• 第三章 基于微流控芯片的抗体固定技术
• 一、研究背景
• 二、实验部分
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 生化试剂
• 2.1.2 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 乙酰化BSA的合成
• 2.2.2 蛋白质含量测定
• 2.2.3 电泳及染色
• 2.2.4 免疫印迹
• 2.2.5 微芯片制备
• 2.2.6 微流控芯片固定抗体
• 2.2.7 原子力显微镜表征Protein A/G修饰的PDMS芯片
• 2.2.8 乙酰化蛋白和肽段的富集
• 2.2.9 胶上酶解及肽段提取
• 2.2.10 MALDI-TOF MS鉴定
• 三、结果与讨论
• 3.1 乙酰化BSA的合成及鉴定
• 3.2 微流控芯片固定抗体
• 3.3 Protein A/G修饰的PDMS芯片表面的表征
• 3.4 微流控芯片固定抗体反应条件的优化
• 3.5 固定抗体的芯片用于乙酰化蛋白的富集
• 3.5.1 富集条件的优化
• 3.5.2 与常用免疫沉淀法的比较
• 3.6 固定抗体的芯片用于乙酰化肽段的富集
• 四、结论和展望
• 参考文献
• 致谢