家蚕核型多角体病毒编码的miRNA及其功能初步研究

2020-12-08阅读(256)

论文摘要

MicroRNAs（miRNAs）是长度为21-25nt非蛋白质编码的小RNAs,它可以调节有关的基因的表达,从而调控生物体的生长、发育和新陈代谢等过程。miRNAs最初在Caenorhabits elegan线虫中发现,最近在很多病毒中也发现有miRNAs的存在。为了研究家蚕核型多角体病毒（BmNPV）miRNAs的功能,本实验分别采用生物信息学预测法和高通量测序的方法鉴定了BmNPV基因组编码的miRNAs;通过在线软件预测了其可能作用的靶基因,并对2个已知的BmNPV miRNAs序列m1和m2进行了功能分析。主要结果如下。（1）BmNPV基因组编码的miRNAs前体的预测与PCR验证。利用VMir软件对BmNPV全基因组进行扫描,通过对所得序列的评分及发夹结构分析,并且排除位于蛋白编码区的序列,最终得到7条可能由BmNPV基因组编码的miRNAs候选前体序列。以家蚕杂交种S16·S17×A1·A16幼虫为实验材料,用浓度5×107 PIB/mL BmNPV添食感染五龄起蚕,72 h后取血淋巴提取总RNA,通过RT-PCR鉴定出5条可能由BmNPV基因组编码的miRNA前体分子。进一步分析5条前体分子的发夹结构,并用RT-PCR验证miRNA成熟体序列,结果在5个前体分子上共扩增出6条和病毒基因组序列一致的成熟体序列,它们分别位于不同的ORF之间,其中2条序列为正向转录序列,4条为反向转录序列。我们认为这6条成熟体序列是BmNPV基因组编码的miRNAs。通过定量分析发现前体序列和成熟体序列随时间增量表达。（2）BmNPV基因组编码的miRNAs前体的高通量测序。采用高通量测序的方法在BmNPV基因组中检测到14条miRNAs。但利用RT-PCR的方法只鉴定出其中7条miRNAs,它们分别位于不同的ORF中,其中3条为正向转录序列,另外4条为反向转录序列。（3）BmNPV基因组编码的miRNAs在病毒基因组上的靶基因预测。利用在线靶基因预测程序RNA hybrid和RNA 22共同预测获得13条BmNPV miRNAs在病毒基因组上的靶基因。结果获得28个可能的靶基因,其中4个是编码囊膜蛋白的基因,3个是编码衣壳蛋白的基因,5个分别是编码lef-5、lef-6、SOD、Polyhedrin以及GP37的基因,16个为非注释基因。由此我们推测BmNPV编码的miRNAs可能参与并调节了病毒感染宿主的过程。（4）BmNPV miRNA序列m1和m2的功能分析。利用RNA hybrid软件预测2个已知的BmNPV miRNA序列m1和m2的靶基因,PCR扩增m1、m2的前体序列和其预测靶基因的3’-UTR序列,分别构建表达miRNA的pcDNA重组质粒和表达靶基因3’-UTR的pGL重组质粒,共转染家蚕BmN细胞。通过双荧光素酶报告基因检测系统分析,过表达m1使pGL-38k 3’-UTR的表达下调14% ;过表达m2使pGL-Polyhedrin3’-UTR和pGL-ODV-EC27 3’-UTR的表达分别下调9.8%和9.2%。结果显示38k与Polyhedrin、ODV-EC27可能为m1与m2的靶基因。

论文目录

摘要

Abstract

第1章绪论

1.1 miRNA 的研究现状

1.1.1 miRNA 的发现与命名

1.1.2 miRNA 的生物学特性

1.1.3 miRNA 的生物合成

1.1.4 miRNA 与病毒

1.1.5 家蚕核型多角体病毒的概况

1.1.6 miRNA 的研究方法

1.2 本课题研究的目的意义和主要研究内容

1.2.1 目的意义

1.2.2 主要研究内容

第2章预测家蚕核型多角体病毒编码的miRNA

2.1 材料与方法

2.1.1 材料与主要试剂

2.1.2 方法

2.2 实验结果与分析

2.2.1 样品准备及RNA 提取

2.2.2 vMir 软件预测BmNPV 可能编码的miRNA 前体

2.2.3 预测前体分子的RT-PCR 检测

2.2.4 成熟序列的预测以及RT-PCR 检测

2.2.5 高通量测序法获得成熟体序列

2.3 讨论

2.4 本章小结

第3章家蚕核型多角体病毒编码的miRNA 的表达定量分析

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 试验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 5 条前体序列的差异表达

3.2.2 成熟体序列差异表达

3.3 实验讨论

3.4 本章小结

第4章 miRNA 作用的初步研究

4.1 材料与方法

4.1.1 材料与主要试剂

4.1.2 实验方法

4.2 结果分析

4.2.1 软件预测靶基因

4.2.2 miRNA 表达载体的构建

4.2.3 3’-UTR 表达载体的构建

4.2.4 检测荧光

4.3 讨论

4.4 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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