论文摘要
目的：结肠癌是世界范围内发病率和死亡率极高的恶性肿瘤之一,而DNA甲基化与结肠癌的关系密切,在结肠癌的发生发展中扮演着极其重要的角色。DNA异常甲基化是可使肿瘤抑制基因发生沉默的新型相关研究机制。本研究的主要目的是了解T-钙粘蛋白（T-cadherin）在结肠癌中的基因功能,检测T-cadherin基因在结肠癌中的表达,通过去甲基化药物5-杂氮-2’-脱氧胞苷酸（5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR）对结肠癌细胞株在体外和体内作用的研究,检测细胞增殖、细胞周期、凋亡、T-cadherin甲基化状态改变和T-cadherin mRNA及蛋白表达变化,探讨DNA甲基化异常与结肠癌间的相关性及5-Aza-CdR抑制结肠癌细胞恶性表型和逆转甲基化状态的作用及其机制。方法：1、用5-Aza-CdR处理结肠癌细胞株HCT116,然后采用倒置相差显微镜观察药物处理前后细胞的变化；采用MTT法观察细胞的生长速度变化；采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率；用甲基化特异性PCR（MSP）检测T-cadherin基因5’CpG岛甲基化状态；采用RT-PCR和Western Blotting法检测T-cadherin mRNA及蛋白的表达情况。2、建立人结肠癌HCT116细胞的裸鼠移植瘤模型,比较5-Aza-CdR给药组和对照组裸鼠移植瘤生长变化,并用MSP, RT-PCR、Western Blotting及免疫组织化学技术对裸鼠移植瘤组织进行T-cadherin基因5’CpG岛甲基化状态、mRNA及蛋白表达变化的检测。结果：1、倒置显微镜下观察发现,对照组细胞形态不规则,呈多边形,贴壁生长,核大、核分裂相多见,细胞数量和增殖速度明显快于给药组；给药组细胞大小较均匀,形态较规则,细胞变圆,皱缩,胞核固缩、增殖分裂减慢,部分细胞有凋亡和坏死；MTT检测发现5-Aza-CdR对HCT116细胞的生长有抑制作用,随浓度的增加而增加；用5μmol/L该药处理细胞五天后,细胞G0/G1期延长,由19.6%增加到60.8%；而S期和G2期均缩短,S期由50.8%减少到24.2%,G2期由18.2%减少到16.3%；细胞总凋亡率给药组与对照组比较,其总凋亡率增加了30.27%；MSP检测经5μmol/L5-Aza-CdR处理五天的HCT116细胞后,对照组T-cadherin基因启动子区域用特异性甲基化引物扩增出目的基因带,去甲基化引物未见扩增出目的基因带,而给药组T-cadherin基因用去甲基化引物均扩增出目的基因带,但甲基化引物均未见扩增出目的基因带,未加DNA模板对照组均未能检测T-cadherin基因甲基化引物扩增片段及去甲基化物扩增片段；RT-PCR检测对照组T-cadherin基因mRNA不能扩增出特异性条带,而给药组HCT116细胞中可检测到T-cadherin基因mRNA表达；Western Blotting检测对照组HCT116细胞中T-cadherin蛋白表达水平明显低于给药组。2、成功建立人结肠癌HCT116细胞的裸鼠移植瘤模型,成瘤率为100%,成瘤时间为肿瘤细胞接种后第8-11天,肿瘤细胞接种后第11天,裸鼠移植瘤直径平均约4mm；5-Aza-CdR处理荷瘤裸鼠14天后,给药组裸鼠形成的肿瘤体积较对照组肿瘤体积小,肿瘤体积的差异随给药时间的延而增大,给药28天后肿瘤体积差异最明显,4周末处死裸鼠后,给药组的肿瘤体积为907±87.29mm3,对照组为1370.93±130.20mm3,给药组肿瘤体积明显小于对照组的肿瘤体积（t=-4.4209,P<0.005）,抑瘤率为34%；用药后各组荷瘤裸鼠用药后体重均有增加,4周末处死裸鼠后,给药组荷瘤裸鼠平均体重为18.06±1.29 g,对照组为17.07±0.84 g,给药组荷瘤裸鼠体重与对照组无明显变化,差别无统计学意义（t=1.3745,P>0.10）；MSP检测结果显示结肠癌裸鼠移植瘤组织中T-cadherin基因在对照组仅有甲基化条带被扩增,而给药组肿瘤组织中出现非甲基化条带；RT-PCR结果显示对照组结肠癌裸鼠种植瘤组织中T-cadherin mRNA均未见表达,而给药组各种植瘤中可见T-cadherin mRNA表达；Western Blotting结果显示给药组肿瘤组织中T-cadherin蛋白表达水平明显高于对照组；免疫组化检测发现对照组裸鼠种植瘤细胞膜上均未见T-cadherin P日性着色,而给药组裸鼠种植瘤细胞膜上可见明显的棕黄色阳性着色。结论：1、T-cadherin基因在结肠癌中表达缺失或下调,其与该基因启动子甲基化有关,可能是结肠癌发生发展的原因之一；2、去甲基化药物5-Aza-CdR能有效逆转体外培养的HCT116细胞T-cadherin基因的异常甲基化,从而激活因甲基化导致T-cadherin基因沉默的再转录,诱导该基因的表达,抑制肿瘤细胞的生长和增殖；3、人结肠癌HCT116细胞在裸鼠皮下有良好的成瘤性。4、5-Aza-CdR对人结肠癌裸鼠移植瘤有抑制作用,能使因甲基化而失活的抑癌基因再转录,诱导该基因的表达,从而抑制肿瘤细胞的生长。