几种抗氧化剂体外抗氧化活性的比较研究

论文摘要

活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS）是机体正常的代谢产物,但其活性具有两面性。低含量的ROS对机体具有一定积极的生理作用。但当其产生和清除之间的平衡遭到破坏时,造成氧化胁迫,这与许多疾病都有密切关系。天然抗氧化剂作为机体抗氧化非酶系统的成分,可直接清除活性氧;还可抑制活性氧的产生;或通过作用于抗氧化反应元件而提高内源性抗氧化物质的水平或抑制氧化酶的表达而减少活性氧的产生。因此,抗氧化剂的介入,可能会有效防治ROS相关疾病的发生和发展。本文对五种天然产物的抗氧化活性进行了检测;测定了两种三萜化合物抑制细胞氧化损伤的活性,并对它们的作用进行了深一步的探讨。在对五种天然产物茜素红（Aliarinred,AR）、白藜芦醇（Resveratrol,Res）、阿魏酸（Ferulicacid,FA）、葛根素（Puerarin,Pue）和芹菜素（Apigenin,Api）进行体外抗氧化活性的检测中,采用甲基紫比色法、MDA法和SDS-PAGE,检测了它们清除羟自由基的能力、对脂质过氧化及蛋白质氧化的保护作用。结果表明,五种化合物在不同的反应体系中表现出不同的抗氧化活性。茜素红清除HO·的能力及对蛋白质氧化的保护作用最强,白藜芦醇对脂质过氧化的抑制作用最强。其中茜素红具有较强的抗氧化活性,其有可能成为一种植物源性的抗氧化剂。齐墩果酸（Oleanolic acid, OA）和熊果酸（ursolic acid, UA）是广泛存在于植物界有相似化学结构的三萜化合物,因其广泛的生物学活性和低毒性备受治疗学的青睐。本文采用过氧化氢对肝癌HepG2细胞氧化损伤模型,在细胞水平对这两个三萜化合物对细胞氧化损伤的保护作用进行了比较研究。采用单细胞凝胶电泳法测定化合物对细胞DNA氧化损伤的保护作用;检测了它们对细胞中脂质过氧化及蛋白质氧化损伤的保护作用;并检测了对细胞中谷胱甘肽（GSH）含量、抗氧化酶SOD、CAT、Gpx活性的影响。结果表明OA和UA在5-20μmol/L均能明显抑制Fe2+诱发的细胞脂质过氧化作用,并呈浓度依赖性。在浓度为20μmol/L时,OA和UA对MDA产生的抑制率分别达到38%和35%。这两种化合物在浓度5-20μmol/L范围均能降低蛋白质羰基含量,抑制蛋白质氧化损伤;减轻HepG2细胞DNA所受氧化损伤。当用300μmol/L浓度过氧化氢处理细胞时GSH含量下降到正常组的36.7%,用5、10和20μmol/L的UA和OA两种三萜预先进行处理时,都可使GSH浓度有一定回升,随着浓度的增高保护作用也提高,并且OA比UA的作用强。浓度为20μmol/L时,OA和UA可使GSH的含量分别提高到氧化胁迫前的78%和74.6%。H2O2诱导的氧化胁迫使HepG2细胞的GPx、SOD、CAT酶活性均有所下降,OA和UA处理后使酶活性升高,当浓度为20μmol/L时,和对照组相比OA和UA使GPx酶活性分别升高了16.1%和13.3%,使CAT酶活性分别升高22.5%和20.7%,使SOD酶活性分别升高6.2 %和7.4%。抑制了H2O2的作用。OA活性稍强于UA。这些结果说明,这两个三萜化合物可有效缓解H2O2引起的氧化胁迫,其作用可能是通过提高细胞内GSH和一系列抗氧化酶GPx、SOD和CAT的水平实现的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 第一节 ROS、抗氧化酶和抗氧化剂的关系
• 1 活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS）—一把双刃剑
• 2 活性氧与抗氧化酶的关系
• 2.1 机体内抗氧化酶对活性氧的清除作用
• 2.2 抗氧化酶之间的关系
• 2.3 活性氧对抗氧化酶的氧化修饰作用
• 3 抗氧化剂及其作用
• 3.1 抗氧化剂种类
• 3.2 抗氧化剂的作用机理
• 3.2.1 抗氧化剂清除自由基的机理
• 3.2.2 抗氧化剂对抗氧化酶和氧化酶的作用
• 4 存在的问题与展望
• 参考文献
• 第二节 化合物抗氧化活性筛选研究方法
• 1 体外筛选抗氧化剂的抗氧化活性研究法
• 1.1 测定抗氧化剂清除自由基能力的方法
• 1.1.1 总自由基的清除法
• 1.1.2 单一自由基的清除法
• 1.2 直接测定对生物大分子的氧化损伤的保护作用
• 1.2.1 脂质过氧化检测法
• 1.2.2 蛋白质氧化损伤检测法
• 1.2.3 DNA氧化损伤检测法
• 1.3 细胞氧化损伤检测法
• 1.4 量子化学计算方法
• 2 体内抗氧化实验
• 参考文献
• 第二章 五种抗氧化剂抗氧化活性的比较研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 HO·的产生及清除
• 1.2.2 对肝脏微粒体脂质过氧化抑制作用的测定
• 1.2.3 对AAPH诱发的牛血清白蛋白氧化降解保护作用的检测
• 2 结果
• 2.1 对HO·的清除作用
• 2.2 对肝脏微粒体脂质过氧化的抑制作用
• 2.3 对牛血清白蛋白氧化降解的保护作用
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 齐墩果酸和熊果酸对肝癌HepG2 细胞的抗氧化保护作用
• 第一节 齐墩果酸和熊果酸研究进展
• 1 齐墩果酸的化学修饰
• 2 药理作用及临床应用
• 2.1 对肝的保护作用
• 2.2 抑制肿瘤形成生长及诱导癌细胞分化作用
• 2.3 对艾滋病病毒的抑制作用
• 2.4 信号转导途径
• 2.5 对心血管作用
• 2.6 其它
• 参考文献
• 第二节 齐墩果酸和熊果酸对肝癌HepG2 细胞抗氧化保护作用
• 前言
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2O₂ 诱导肝癌HepG2 细胞损伤模型的建立'>2.2 H₂O₂ 诱导肝癌HepG2 细胞损伤模型的建立
• 2.3 MTT法检测细胞存活率
• 2.4 倒置显微镜观察细胞形态变化
• 2.5 MDA的测定
• 2.6 GSH的测定
• 2.7 GPx 酶活性的测定
• 2.8 SOD、CAT酶活性的测定
• 2.9 蛋白质羰基含量的测定
• 2.10 DNA单细胞凝胶电泳
• 2.11 蛋白质含量测定
• 2.12 统计学处理
• 3 结果
• 2O₂对肝癌HepG2 细胞的细胞毒作用'>3.1 OA和UA 及H₂O₂对肝癌HepG2 细胞的细胞毒作用
• 3.2 抗脂质过氧化作用
• 3.3 对蛋白质羰基形成的抑制作用
• 3.4 对DNA损伤的保护作用
• 3.5 对GSH含量的影响
• 3.6 对抗氧化酶活性的影响
• 4 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢