论文摘要
1目的药物成瘾是一个世界范围内日趋严重的医学和社会问题，世界各国无一幸免地受到毒品的侵袭。药物成瘾是以失去控制能力、强迫性连续用药为主要特征的慢性复发性脑疾病。成瘾行为形成过程中有多种学习记忆系统的参与。研究表明，成瘾和学习记忆过程有很多相同的神经生物学改变，与学习记忆有关的重要脑区、功能分子和信号转导系统参与了药物依赖的形成和心理渴求导致的复吸。因此，了解有成瘾特征化的学习记忆机制对探求成瘾的本质有重要意义。长时程增强（long-term potentiation，LTP）作为学习和记忆的模式已经得到公认，并且是陈述性记忆的分子机制。在LTP诱导过程中必须有Ca2+／钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）参与和活化，CaMKⅡ可能是记忆的分子基础。CaMKⅡ是学习记忆和药物成瘾过程的共同影响因子，可以作为研究药物成瘾和学习记忆共同生物学机制的指标。其中CaMKⅡα亚基与空间学习能力密切相关。针对以上机制，我们的研究集中在目前国际上的一个热点——芋螺毒素上。芋螺毒素（CTX）是一类来源于海洋软体生物芋螺（Conus）的活性多肽。芋螺毒素按其作用靶位可分为ω-、δ-、α-和conantokins等类型，其中ω-CTX MVⅡA选择性作用于N型电压门控钙通道（N-VGCCs），而conantokins选择性作用于N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体。已有研究表明，钙离子通道和谷氨酸受体尤其是NMDA受体参与了药物依赖的形成。其可能的作用途径是：本研究利用自行开发的视频跟踪-计算机自动分析CPP模型系统，建立吗啡诱导的小鼠CPP形成模型，检测芋螺毒素类似物[Glu3，4，7，10，14]-conantokin G对吗啡诱导小鼠CPP表达的影响，评价其在干预吗啡精神依赖方面的药效，与本实验室前期工作进行比较，并探讨CaMKⅡ在吗啡成瘾相关脑区所起的作用。2材料和方法2．1实验动物清洁级雄性昆明种小鼠，体重18～20g。独立通风笼具（IVC）饲养，每笼4只，自由摄取食物和水。2．2药物盐酸吗啡注射液（沈阳第一制药厂）；生理盐水（浙江平湖莎普爱思制药有限公司）；[Glu3，4，7，10，14]-conantokin G（Sigma）。anti-CaMKⅡα抗体（Sigma）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（北京中杉生物有限公司）、Monoclonal Anti-β-Actin（Sigma）、HRP标记的羊抗鼠二抗（北京中杉生物有限公司）。2．3 CPP实验装置视频跟踪—计算机自动分析CPP模型系统：4个相同的长方形PVC材料穿梭盒（30 cm×15 cm×15 cm）组成一个45 cm×45 cm×15 cm的正方形盒子，每个盒子被一个隔板分成两个大小相同的正方形盒子（15 cm×15 cm×15 cm），其中一个盒子四周均为白色，底面光滑，做为伴药盒；另一个四周均为黑色，底面镂刻成网格。摄像系统可以完整记录小鼠的活动情况，采集的视频图像用自行开发的MiceTrack软件进行分析。2．4 CPP训练程序：包括自然偏爱测试、条件性位置偏爱（CPP）的建立和表达，具体操作步骤如下：自然偏爱测试：实验开始前三天，穿梭盒中间采用通道型隔板，将小鼠放置两盒交界处，让其在两盒内自由活动15分钟，摄录活动情况，以便分析其天然偏爱情况。CPP的建立：隔板将穿梭盒分隔成两个独立的盒子，实验组小鼠在d1、d3、d5、d7天给予吗啡（5 mg／kg）后放置白盒训练50分钟；d2、d4、d6、d8天给予生理盐水后放置黑盒训练50分钟。对照组小鼠均给予生理盐水，其它处理同实验组小鼠。CPP的表达：在实验的d9天，将中间隔板换成通道型，小鼠未作任何处理放置两盒交界处，让其在两盒内自由活动15分钟，摄录其活动情况，用MiceTrack软件分析小鼠在黑盒和白盒内的停留时间，作为位置偏爱的评价指标。2．5芋螺毒素给药处理芋螺毒素类似物[Glu3，4，7，10，14]-Conantokin G（Glu-Con G）以生理盐水做溶剂。在吗啡诱导CPP表达测试前半小时，小鼠侧脑室分别给予Glu-Con G 30、60、120 pmol，给药容量为5μl／只。2．6 CaMKⅡα表达量测定步骤：总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。灌制SDS-PAGE（10％的分离胶和5％的积层胶），将配成相同蛋白浓度并处理好的蛋白样品上样（每孔20μg），电泳（110 V，1.5 h），用湿电转膜法将蛋白转至硝酸纤维膜（Amersham公司）（110 V，2 h）。取出膜放入含5％脱脂奶粉的TBST液，室温轻摇2 h，取出膜，放入anti-CaMKⅡα一抗液（1∶3000稀释），4℃孵育过夜。TBST液快速摇洗后（25 min），将膜放入HRP标记的抗兔第二抗体（1∶3000稀释），室温下孵育2小时，TBST液快速摇洗后（25 min），置等体积ECL A液和ECL B液混合的发光剂底物液中1 min，曝光1 min后，显影、定影。用TBST快速洗膜20 min，将膜放入anti-Actin一抗（1∶5000），室温孵育2小时；用TBST快速洗膜25 min，将膜放入anti-mouse第二抗体中，温和振荡2小时；用TBST快速洗膜25 min；ECL A液和ECL B液等体积混合后，将膜在ECL中温浴1 min；曝光1 min，将胶片显影、定影。2．7实验观察指标及统计分析位置偏爱指标：白盒（伴药盒）停留时间；运动活性指标：总运动距离；探索活动指标：穿梭次数，总中心徘徊距离，总中心停留时间，白盒中心徘徊距离，白盒中心停留时间。均用均数±标准误表示。P＜0.05视为有统计学差异。Western blotting胶片用GS-800扫描入计算机，用Biorad quantity one 4．4．0 densitomonter图像分析软件计算每张胶片中各条带的灰度，以相应条带的内参Actin的平均灰度做标准，计算CaMKⅡα各条带与之比较的相对比值，计算其余各条带与之比较的相对比值，进行定量分析。3结果3．1吗啡诱导的条件性位置偏爱模型的建立天然偏爱结果显示：小鼠在黑盒停留时间（s）较白盒长（分别为504.0±25.1和396.6±25.1，P＜0.05），对黑盒有所偏爱。5mg／kg吗啡组小鼠在白盒停留时间显著长于对照组（分别为573.2±53.0和441.1±39.3，P＜0.05），提示小鼠已建立对白盒的偏爱。3．2芋螺毒素对吗啡诱导CPP表达的干预作用吗啡诱导的CPP表达阶段，芋螺毒素类似物Glu-Con G处理组（0、30、60、120 pmol）同吗啡对照组相比，白盒停留时间呈剂量依赖性减少，各组运动活性及探索活动比较无显著性差异。相关性分析后，各组位置偏爱同运动活性及探索活动无相关性。3．3芋螺毒素类似物Glu-Con G与GST-CTX MVⅡA及Con G拮抗吗啡CPP表达的作用比较同等剂量（0.003 mg／kg）的芋螺毒素侧脑室给药，Con G比Glu-Con G干预小鼠位置偏爱的作用稍强，但两者之间无显著性差异；而GST-CTX MVⅡA的有效剂量约为两者的十倍。3．4 CaMKⅡα在芋螺毒素GST-CTX MVⅡA干预吗啡CPP表达的前额叶皮质（PFC）和海马（HP）脑区表达量的变化吗啡组和0.01 mg／kg GST-CTX MVⅡA干预组PFC和HP脑区CaMKⅡα蛋白表达增多，均明显高于生理盐水对照组（P＜0.05）；同吗啡组相比，0.03、0.1 mg／kgGST-CTX MVⅡA干预组和盐水组PFC和HP脑区CaMKⅡα蛋白表达下降（P＜0.05）。4结论4．1改进、完善的视频跟踪—计算机自动分析CPP模型系统能成功分析小鼠位置偏爱指标、运动活性指标及探索活动指标，结果稳定可靠；4．2 [Glu3，4，7，10，14]-Conantokin G能有效干预吗啡诱导的CPP的表达；4．3 [Glu3，4，7，10，14]-Conantokin G在本实验剂量范围内不引起小鼠运动活性及探索活动的异常，小鼠位置偏爱与运动活性及探索活动无相关性；4．4 GST-CTX MVⅡA阻断Ca2+通道，降低CaMKⅡα的表达水平，为证明CaMKⅡ参与药物成瘾提供了更多实验依据。