小麦耐盐相关基因cDNA的克隆与功能研究

论文题目: 小麦耐盐相关基因cDNA的克隆与功能研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物学

作者: 葛荣朝

导师: 黄占景,沈银柱

关键词: 小麦,耐盐,小麦丝氨酸,苏氨酸激酶

文献来源: 河北师范大学

发表年度: 2005

论文摘要: 世界上存在着大面积的盐碱地,高浓度的盐胁迫造成植物生长严重停滞,甚至导致死亡。盐碱耕地中种植的作物往往发生大幅的减产。近年来,利用转基因操作直接将植物耐盐基因转入相应的作物,已经成为耐盐作物育种最为有效的手段之一。进行作物刚盐基因工程育种,首要的前提就是要获得有效的耐盐基因。本论文的目的就是在前人的工作基础上,进一步对小麦耐盐相关基因的cDNA全长序列进行克隆,并初步对其耐盐功能进行研究,为将来小麦耐盐基因工程的开展做一些有益的探索。本研究首先利用种子活力指数、相对根长、细胞质膜透性和SOD酶活性指标,对小麦突变体后代中得到的一系列近等位基因系进行了苗期耐盐性检测。检测结果表明与大田盐池的检测结果基本吻合,确定了耐盐品系RH8706-49和敏盐品系H8706-34在苗期的耐盐性也存在着一定的差异,可以作为后续研究的实验材料。通过对26个利用cDNA-AFLP技术得到的cDNA序列进行反向Northern实验,结果表明只有6个cDNA片段出现阳性杂交信号,其余20个cDNA片段没有明显的杂交信号。根据NCBI-BLAST的信息,我们选择23和88号作为研究目标,对其基因全长利用3′RACE和5′RACE方法进行研究。另外,在利用NCBI-BLASTn对其余33个差异片段进行比对时,又发现81号cDNA片段可以利用电子拼接得到其全部3′序列的信息及其转录方向。 23号cDNA片段经过3′RACE和电子拼接得到其3′部分的1210bp序列,其中开放阅读框834 bp,共编码277个氨基酸。软件预测,该部分肽段的分子量为31426.05D,等电点为4.85,并含有66.8%的α螺旋结构(Alpha),很可能具有钙调素结合域和Cytochrome P450半胱氨酸亚铁血红素结合区域。该肽段第216到236个氨基酸区域属于一个较为可信的跨膜区域,另外通过NCBI比对分析,该部分氨基酸序列与cytochrome P450(pfam00067.11)具有较高的同源性。因此,23号cDNA编码的肽段初步可以认为具有依赖于钙调素调节的Cytochrome P450活性。 81号cDNA经过5′RACE扩增得到890bp的cDNA全长序列,其中开放阅读框663bp,共编码220个氨基酸。经软件推测,81号基因编码的蛋白质分子量为24918.06D,等电点为8.3,含有44.1%的β螺旋结构和38.2%的α螺旋结构。通过软件检测发现该蛋白序列存在两个跨膜区域,其中第79到99个氨基酸区域属于较为可信的跨膜区域。软

论文目录:

中文摘要

英文摘要

缩写词及专用名词

第一篇文献综述

第一章植物耐盐机制的研究进展

1 盐渍环境对植物的伤害

1.1 膜损伤

1.1.1 离子毒害

1.1.2 活性氧伤害

1.2 光合下降、耗能增加

1.3 营养离子吸收不平衡

2 植物耐盐机理的研究

2.1 渗透调节

2.1.1 多元醇

2.1.2 脯氨酸

2.1.3 甜菜碱

2.2 消除Na~+毒害的策略——离子平衡

2.2.1 Na~+的吸收

2.2.2 Na~+的外排

2.2.3 盐的区隔化

2.3 调节水通道的活性

2.4 改变光合作用途径

2.5 清除细胞中的活性氧

3 盐胁迫信号传递途径

第二章植物蛋白激酶的研究进展

1 蛋白激酶的分类

2 与植物抗逆相关的的蛋白激酶

2.1 受体蛋白激酶

2.2 促分裂原活化蛋白激酶

2.3 核糖体蛋白激酶

2.4 转录调控蛋白激酶

2.5 钙依赖蛋白激酶

第三章植物耐盐基因工程研究进展

1 植物基因的克隆方法

1.1 对已知序列进行分子克隆

1.2 从蛋白质到基因序列

1.3 根据植株或细胞的表型变异进行基因分离

1.3.1 转座子示踪技术

1.3.2 基因挽救技术

1.3.3 基因组相减技术

1.3.4 cDNA差式显示和差式分析法

1.3.5 cDNA-AFLP

1.4 与已知基因紧密连锁基因的分离

1.5 利用cDNA末端快速扩增技术获得基固cDNA全长

1.5.1 3′RACE

1.5.2 5′RACE

1.5.3 RACE实验中引物设计的注意事项

2 耐盐相关基因及其研究进展

第四章植物遗传转化研究进展

1 植物遗传转化的方法

1.1 农杆菌介导的遗传转化法

1.1.1 农杆菌介导的遗传转化法的发展与优化

1.1.2 农杆菌介导的遗传转化机理

1.1.3 农杆菌介导的遗传转化法的应用

1.2 基因枪法

1.3 电击法和PEG法

1.4 花粉管通道法

2 表达载体的构建

2.1 启动子

2.2 选择标记基因

第五章研究目的及意义

1 本室小麦耐盐相关基因的研究进展

2 本研究的目的及意义

第二篇研究报告

第一章小麦耐盐突变体的耐盐性检测

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 发芽测定种子活力实验

1.2.2 胚根细胞质膜透性的测定

1.2.3 SOD酶活性的测定

2 结果与分析

2.2.1 发芽测定种子活力实验结果与分析

2.2.2 胚根细胞质膜透性的测定

2.2.3 SOD酶活性的测定结果

第二章小麦耐盐相关基因的反向Northern检测

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 质粒的提取

1.2.2 反向Northern杂交

2 结果与分析

2.1 质粒提取和扩增检测结果

2.2 RNA提取电泳检测结果

2.3 反向Northern结果

3 讨论

第三章小麦耐盐相关基因的3′RACE

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 3′RACE引物的设计

1.3 实验方法

1.3.1 总RNA的提取

1.3.2 目的基因的3′RACE扩增

1.3.3 PCR产物的回收

1.3.4 PCR产物与T-载体(PGEM-T)的连接

1.3.5 大肠杆菌感受态细胞的制备

1.3.6 连接产物的转化

1.3.7 序列的比较和分析

2 结果与分析

2.1 RNA提取和鉴定

2.2 23号cDNA片段的3′RACE

2.3 88号cDNA片段的3′RACE

第四章小麦耐盐相关基因的5′RACE

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 总RNA的提取

1.2.2 5′RACE

2 结果与分析

2.1 RNA提取和鉴定

2.2 88号cDNA片段的5′RACE

2.3 81号cDNA片段的5′RACE

第五章小麦TaSTK基因的Northern杂交

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 RNA提取和检测

1.2.2 Northern杂交

2 结果与分析

2.1 RNA提取和鉴定

2.2 PCR标记探针的预扩增实验

2.3 TaSTK基因的Northern杂交

第六章 TaSTK基因功能的初步研究

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 质粒的酶切及目的片段的回收

1.2.2 连接反应

1.2.2 连接产物转入大肠杆菌

1.2.3 双元表达载体p1300：35S：TaSTK：NOS转化农杆菌

1.2.4 根癌农杆菌GV3101转化拟南芥

1.2.5 阳性植株的筛选和TaSTK基因功能的初步研究

2 结果与分析

2.1 双元表达载体p1300：35S：TaSTK：NOS的构建和大肠杆菌、农杆菌转化

2.2 农杆菌转化拟南芥

2.2.1 阳性植株的筛选及转化率统计

2.2.2 小麦丝氮酸／苏氨酸激酶对拟南芥主根生长的影响

2.2.3 小麦丝氨酸／苏氨酸激酶对拟南芥侧根生长数量的影响

2.3 转基因植株的PCR鉴定

2.4 转基因植株的RT-PCR鉴定

第七章讨论

1 TaSTK属于与小麦抗逆相关的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶

2 细胞色素P450家族与植物抗性的关系

3 对目的片段进行反向Northern杂交和Northern杂交结果的相互验证

4 RACE技术应该注意的一些事项

5 电子拼接技术在基因序列研究中的应用

第八章结论

附录

参考文献

攻读博士期间发表的学术论文

致谢

发布时间: 2005-08-08

参考文献

[1].小麦木聚糖酶抑制蛋白的性质及对外源木聚糖酶功效的影响研究[D]. 刘新育.河南农业大学2016
[2].圆锥小麦地方品种遗传多样性研究[D]. 李伟.四川农业大学2006
[3].转雪花莲凝集素基因小麦抗蚜性及建立高效小麦转化体系的研究[D]. 梁辉.华中农业大学2005

小麦耐盐相关基因cDNA的克隆与功能研究

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