一、只有B淋巴细胞才能表达免疫球蛋白?（论文文献综述）
张贤政[1]（2021）在《IgD-Fc-Ig融合蛋白通过抑制B细胞IgDR-Syk-Btk-NF-κB信号通路对小鼠CIA治疗作用的研究》文中研究说明类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种靶向滑膜的自身免疫性疾病,具有滑膜增生、软骨破坏、血管翳形成和系统性炎症的病理特征。RA的发病机制复杂,多种免疫细胞参与其中,如B淋巴细胞、T细胞、巨噬细胞和树突状细胞等。B淋巴细胞作为一种重要的适应性免疫细胞在RA的发病过程中扮演重要角色,T/B淋巴细胞相互作用,促进浆细胞的分化和成熟,浆细胞负责产生自身抗体参与疾病发展;活化的B淋巴细胞诱导效应T细胞的分化,效应T细胞产生大量促炎细胞因子如白细胞介素1（interleukin-1,IL-1）、IL-6、IL-17和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等;B淋巴细胞也通过分泌细胞因子如IL-10等作用于其他免疫或非免疫细胞（如巨噬细胞、滑膜细胞以及软骨细胞等）参与RA疾病的发展。免疫球蛋白D（immunoglobulin D,IgD）是免疫球蛋白家族一员,最早发现于多发性骨髓瘤中,由于其结构特殊及含量水平较低,至今其功能尚不清楚。课题组前期研究表明RA等自身免疫性疾病中IgD的水平显着升高,IgDR在T细胞、B淋巴细胞、成纤维样滑膜细胞和巨噬细胞等免疫细胞表面均有表达,且IgD可以促进RA病人外周血单核细胞的活化,提示IgD可能通过结合IgDR在RA的发病过程中发挥重要作用。B淋巴细胞受体（B cell receptor,BCR）是一种由膜型免疫球蛋白（membrane immunoglobulin,mIg）非共价偶联Igα和Igβ形成的复合型受体,BCR受体对于维持B淋巴细胞的存活、分化、增殖和抗体分泌功能至关重要。当抗原与BCR结合时,Igα和Igβ其细胞质尾部的免疫受体酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM）将会募集酪氨酸如脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase,Syk）和布鲁顿氏酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase,BTK）,并使其发生磷酸化使得抗原刺激信号被放大并向下游进行传递,Src家族酪氨酸激酶Lyn,通过与CD22等分子胞内的免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif,ITIM）结合并发生磷酸化,负性调控BCR信号的激活,充当调控BCR活化阈值的作用。课题组前期利用重叠PCR等技术成功构建pET28a（+）-DG重组质粒,并在原核生物大肠杆菌中成功纯化出重组融合蛋白IgD-Fc-Ig（DG）,DG能否抑制IgD与B淋巴细胞表面的IgD受体（IgD receptor,IgDR）结合?DG对小鼠胶原诱导型关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）是否具有治疗作用?DG是否可以通过抑制IgD与IgDR结合,发挥调控B淋巴细胞分化和功能的作用?如果可以调控B淋巴细胞的分化和功能是否是通过BCR信号通路发挥调控作用的?目前这些问题尚不清楚。本课题拟以CIA小鼠、Daudi和Ramos细胞为研究对象,采用流式细胞技术、激光共聚焦技术、实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）、免疫蛋白印迹法（western blot,WB）、蛋白质芯片技术、苏木素-伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色和免疫组化等方法研究DG对CIA小鼠是否具有治疗作用以及对B淋巴细胞亚群和功能的影响。在体外构建Lyn过表达质粒再将过表达质粒转染Daudi细胞、利用规律成簇的间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic,CRISPR）/Cas9构建BCR敲除Ramos细胞进一步阐明IgD通过IgDR-BCR信号通路对B淋巴细胞活化的机制。为研究IgD通过活化B淋巴细胞促进RA病理过程的机制、为评价DG对小鼠CIA模型的治疗作用以及为将DG开发成为一种新型治疗RA的药物提供实验依据。目的:1.研究IgD通过激活IgDR-Syk-Btk-NF-κB信号通路促进B淋巴细胞功能。2.明确DG对小鼠CIA的治疗作用及对B淋巴细胞分化、活化和增殖等功能的影响。3.揭示DG通过抑制IgD与B淋巴细胞表面的IgDR结合,进一步抑制IgD-IgDR-Syk-Btk-NF-κB信号通路发挥对小鼠CIA的治疗作用。方法:1.使用热休克法将pET28a（+）-DG重组质粒转化至BL21感受态细菌中,通过对阳性转化子进行摇菌培养,通过异丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG）诱导重组质粒表达DG,离心分离出细菌沉淀,经裂解、超声破碎、蛋白纯化仪纯化和分子筛过滤除杂得到融合蛋白DG。2.使用荧光素标记试剂盒,将IgD和DG标记上FITC标签。在体外通过免疫磁珠分选出小鼠CD19+B淋巴细胞,通过设定细胞密度为1×106/ml,通过调整IgD-FITC或DG-FITC浓度为0、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30和100μg/ml,使用流式细胞仪检测不同浓度IgD-FITC或DG-FITC孵育处理的小鼠B淋巴细胞FITC荧光强度,IgD受体的表达即为平均荧光强度（mean fluorescent intensity,MFI）表示。同法检测IgD和DG对Daudi和Ramos细胞平衡解离常数KD和最大结合量Bmax,以及DG抑制IgD与小鼠B淋巴细胞、Ramos和Daudi细胞表面IgDR结合的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）。3.选取20g左右雄性DBA/1小鼠建立CIA模型,将造模成功的DBA1小鼠随机分为CIA组、DG低剂量组（1.625 mg/kg）、DG中剂量组（3.25 mg/kg）、DG高剂量组（6.5 mg/kg）、Ig G1-Fc（6.5 mg/kg）阴性对照组、依那西普（5 mg/kg）和利妥昔单抗组（5 mg/kg）,未进行造模的DBA1小鼠作为正常对照组。腹腔注射给药,通过评价体重、关节炎指数、足爪肿胀数、踝关节HE染色、脾脏组织HE染色等指标评价治疗效果;4.在第19、31、42和66天尾静脉取血,利用流式细胞技术检测初次免疫后、二次免疫后、炎症高峰期和炎症消退期CIA小鼠外周血以及脾脏组织中CD19+总B细、CD19+CD27+记忆B淋巴细胞、CD19-CD138+浆细胞、CD19+Ig M+未成熟B淋巴细胞和CD19+IgD+成熟B淋巴细胞水平的变化,研究DG对CIA小鼠外周血以及脾脏组织中B淋巴细胞亚群的影响;5.通过蛋白质芯片技术分析各组小鼠血清中免疫球蛋白各亚型水平,评价DG对CIA小鼠B淋巴细胞功能的影响;6.使用免疫荧光技术和WB法检测脾脏组织中p-Lyn、p-Syk、p-Btk、p-P38和p-P65水平;7.使用免疫组化检测各组小鼠踝关节和滑膜组织中基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase,MMP-13）、核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）和Ⅱ型胶原的表达情况;8.在体外利用Daudi细胞株进行Lyn过表达,s IgD刺激,同时给予不同梯度的DG进行干预,使用Western Blot、免疫荧光和流式细胞技术检测中p-Lyn、p-Syk、p-Btk、p-P38和p-P65水平,使用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,CO-IP）技术检测Lyn与Syk、Syk与Btk蛋白之间相互作用;9.使用免疫荧光技术检测IgD刺激下Daudi细胞NF-κB p65核易位及p-NF-κB p65的表达情况;10.使用qRT-PCR检测IgD刺激下对Daudi细胞中Bach2、Bcl6、IRF4、E2A、Pax5和Blimp-1转录因子水平变化情况及DG的干预作用;11.使用单载体Cas9-U6-sgRNA（Igα+Igβ）质粒构建Igα-/-Igβ-/-Ramos细胞,使用IgD进行刺激,使用WB检测IgD对Igα-/-Igβ-/-Ramos细胞中p-Lyn、p-Syk、p-Btk、p-NF-κB的水平;12.使用单载体慢病毒构建Igβ-/-Ramos,进一步检测IgD对BCR信号通路的活化,寻找IgD活化B淋巴细胞的机制;13.使用q RT-PCR检测IgD刺激下的Igα-/-Igβ-/-和Igβ-/-Ramos细胞中Bach2、Bcl6、IRF4、E2A、Pax5和Blimp-1因子表达情况。结果:1.B淋巴细胞表面存在IgDR,DG可以抑制IgD与小鼠B淋巴细胞、Daudi和Ramos细胞株表面IgDR结合免疫荧光结果显示小鼠B淋巴细胞表面存在IgDR,且与IgD-BCR和Ig M-BCR存在共定位。流式结果表明IgD和DG在体外可以与小鼠CD19+B淋巴细胞、Daudi和Ramos细胞的结合,DG可以抑制IgD对小鼠B淋巴细胞、Daudi和Ramos细胞表面IgDR的结合,IC50分别为7.58μg/ml、8.86μg/ml和11.45μg/ml。2.DG对CIA小鼠具有治疗作用通过腹腔注射给药,每三天给药一次,同时称量各组小鼠体重,对各组小鼠足爪肿胀数以及关节炎指数进行评分。结果表明DG对CIA小鼠具有显着的治疗作用,可以减轻CIA小鼠足爪红肿症状,缓解CIA小鼠体重的降低,抑制关节炎指数以及足爪肿胀数。3.DG在可以抑制T/B淋巴细胞活力,降低CIA小鼠胸腺和脾脏指数分离出各组小鼠脾脏T/B淋巴细胞,细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）法检测DG对刀豆素A（concanavalin A,Con A）/脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）刺激下T/B淋巴细胞活力的影响,结果表明DG具有抑制T/B淋巴细胞增殖反应的能力。通过计算各组小鼠胸腺和脾脏指数,结果表明DG可以抑制CIA小鼠的胸腺和脾脏指数。4.DG对CIA小鼠外周血中记忆B淋巴细胞、浆细胞和成熟B淋巴细胞水平具有调控作用使用流式细胞技术检测不同炎症阶段各组小鼠外周血中B淋巴细胞亚群的百分比。结果表明DG可以降低异常升高的记忆B淋巴细胞（CD19+CD27+）、浆细胞（CD19-CD138+）和成熟B淋巴细胞（CD19+IgD+）的水平,对未成熟B淋巴细胞（CD19+Ig M+）水平未观察到显着影响。5.DG可以改善CIA小鼠脾脏和踝关节病理评分HE染色结果表明DG可以改善脾脏和踝关节的病变,具体表现为DG可以降低CIA小鼠脾脏组织中动脉周围淋巴鞘密度和淋巴滤泡数量,改善边缘区和红髓增生。DG可以抑制CIA小鼠踝关节组织中淋巴细胞浸润和滑膜增生,同时减少血管翳的形成和骨破坏。6.DG对CIA小鼠脾脏组织B淋巴细胞亚群具有调控作用使用流式细胞技术检测各组小鼠脾脏组织中B淋巴细胞亚群的变化,结果表明DG可以降低CIA小鼠脾脏组织中总B淋巴细胞、记忆B淋巴细胞、浆细胞和成熟B淋巴细胞的百分比,对未成熟B淋巴细胞未见显着影响。7.DG对CIA小鼠血清中免球蛋白水平具有调节作用使用蛋白质芯片检测各组小鼠血清中免疫球蛋白各亚型的变化情况,DG可以抑制CIA小鼠中异常升高的Ig A、Ig M、IgD、Ig G1、Ig G2b、Ig G3和lambda水平,对Ig E、kappa和Ig G2a的水平无明显改变,表明DG对B淋巴细胞的功能具有调节作用,减少免疫球蛋白的分泌。8.DG可以降低CIA小鼠踝关节软骨和滑膜组织中MMP-13和RANKL的表达,对Ⅱ型胶原具有保护作用免疫组化结果表明DG可以增加CIA小鼠关节中Ⅱ型胶原的水平,同时减少滑膜组织和软骨组织中的RANKL和MMP-13的水平,表明DG对CIA小鼠关节具有明显的保护作用。9.DG可以升高脾脏组织中p-Lyn的水平,降低p-Syk、p-Btk、p-NF-κB p65和p-P38的表达免疫荧光结果表明DG可以升高CIA小鼠脾脏组织B淋巴细胞中Lyn的磷酸化水平,减少Syk和Btk的磷酸化。WB检测结果与免疫荧光结果一致,DG可以降低p-Syk、p-Btk、p-NF-κB p65和p-P38的表达,表明DG对BCR信号通路具有调控作用。10.IgD在体外对Daudi细胞信号通路具有激活作用,DG可以抑制IgD对BCR信号的激活IgD在体外可激活Daudi细胞BCR信号通路,增加Syk和Btk的磷酸化水平,抑制Lyn的磷酸化,DG 10μg/ml可显着抑制IgD对BCR信号的激活,减少p-Syk、p-Btk、p-NF-κB p65和p-P38的水平。11.DG可以抑制IgD刺激下Daudi细胞NF-κB p65的核易位,降低p-NF-κB p65的水平免疫荧光结果表明IgD 5μg/ml可以显着促进Daudi细胞NF-κB p65易位入核,同时核内p-NF-κB p65表达显着增加。DG 10μg/ml可以显着减少NF-κB p65的入核,同时减少NF-κB p65的磷酸化水平。12.DG可以逆转IgD对Daudi细胞Bach2、Bcl6、IRF4、E2A、Pax5和Blimp-1转录因子水平的影响qRT-PCR结果显示IgD 5μg/ml可以增加Daudi细胞中Blimp-1、PAX5、E2A和IRF4的转录水平,同时抑制Bach2和Bcl6转录。DG 10μg/ml可以显着抑制IgD刺激下Blimp-1、PAX5、E2A和IRF4转录,升高Bach2和Bcl6转录水平。13.IgαIgβ或Igβ的缺失可以抑制IgD对Ramos细胞BCR信号的激活WB结果表明,IgαIgβ或Igβ的敲除可以抑制IgD对Ramos细胞BCR信号的激活,与WT+IgD组相比,在Igα-/-Igβ-/-和Igβ-/-Ramos细胞中可显着减少IgD刺激引起的Syk、Btk、NF-κB p65和p38的磷酸化水平。14.IgαIgβ或Igβ的缺失可以逆转IgD对Ramos细胞转录因子水平的影响在Ramos细胞中,IgD可以抑制Bach2和Bcl6的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid,m RNA）水平,促进E2A、IRF4的PAX5转录,对BLIMP-1无显着影响。Igβ或IgαIgβ的缺失可以逆转IgD刺激引起的IRF4的升高,此外Igβ或IgαIgβ的敲除后,与WT组相比,Bcl6、E2A、PAX5和BLIMP-1 mRNA水平显着降低。结论:1.IgD在体外能通过调控IgD-IgDR-Syk-Btk信号通路发挥对B淋巴细胞激活作用。2.DG融合蛋白在体外可以抑制IgD与小鼠B淋巴细胞、Daudi和Ramos细胞的结合。3.DG对CIA小鼠具有显着的治疗作用,对CIA小鼠B淋巴细胞亚群和功能具有调控作用。4.DG可以通过抑制IgD与IgDR的结合抑制IgD-IgDR-Syk-Btk信号通路的激活,进一步抑制B淋巴细胞的活化发挥对CIA小鼠的治疗作用。5.DG可能是一种新的治疗RA的生物制剂,在临床具有潜在的治疗作用。
郭云柯[2]（2020）在《滋阴疏肝法对原发性干燥综合征B淋巴细胞的影响及雷公藤甲素对NOD小鼠唾液腺损伤的研究》文中研究表明研究目的经过多年的临床观察,我们发现原发性干燥综合征（pSS）患者出现焦虑症、抑郁症或合并焦虑状态、抑郁状态者非常多,这与患者因疾病引起的不适症状、药物的不良反应等均有密切关系。祖国医学中,郁责之于肝,郁证的发生与肝密切相关。故我们认为pSS以肝阴（血）不足、肝失疏泄为主要病机,提出以滋阴疏肝为治疗大法,运用一贯煎加减方治疗pSS阴虚肝郁证患者。本研究:1.在从肝论治,滋阴疏肝理论指导下运用一贯煎加减方治疗pSS阴虚肝郁证患者,通过临床观察和动物实验,从多角度系统探讨从肝论治,滋阴疏肝治疗pSS的理论和临床依据。2.通过JAK/STAT和NF-K B信号通路,观察不同剂量雷公藤甲素对NOD小鼠唾液腺损伤的疗效,探讨雷公藤甲素治疗pSS的机制。研究方法1.一贯煎加减方对原发性干燥综合征阴虚肝郁证患者疗效及B淋巴细胞影响的临床研究本研究选择60例江苏省中医院已经确诊的pSS阴虚肝郁证患者,10例健康对照者为研究对象,取pSS阴虚肝郁证患者及健康对照者外周血5-10ml,检测B细胞活化、分化表面标记、Tfh细胞比率、B细胞增殖能力、B细胞凋亡水平及IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10和IL-27水平。再将pSS阴虚肝郁证患者分为2组,试验组30例,对照组30例,分别服用一贯煎加减方及羟氯喹,观察治疗前后的临床疗效,以及测定治疗后B细胞活化、分化表面标记、Tfh细胞比率、B细胞增殖能力、B细胞凋亡水平以及血清IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10 和 IL-27 水平。2.一贯煎加减方对NOD小鼠B淋巴细胞的影响选择NOD小鼠60只及正常ICR小鼠10只,NOD小鼠随机分为6组,每组10只,即模型组、高浓度复方药组、中浓度复方药组、低浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组,ICR小鼠为正常组。观察小鼠每天饮水量,每周测定小鼠唾液流量,8周后处死小鼠,计算脾指数、颌下腺指数,测定每组小鼠外周血B细胞活化、分化表面标记、Tfh细胞比率、B细胞增殖能力、B细胞凋亡水平以及血清IgG、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、BAFF和IL-27水平。3.雷公藤甲素（TP）通过JAK/STAT和NF-κB信号通路减轻NOD小鼠唾液腺损伤的研究选择雌性NOD小鼠48只,随机分为4组,每组12只,即对照组（安慰剂）小剂量TP组、中剂量TP组、大剂量TP组。每隔2周检测小鼠唾液分泌量。90天后处死小鼠,取唾液腺和脾脏称重,计算唾液腺指数和脾脏指数;检测TNF-α、IL-2和IL-6;取唾液腺,评价组织病理学;分析小鼠唾液腺淋巴细胞分布;进行脾脏T细胞和B细胞增殖试验;提取唾液腺组织蛋白,检测蛋白表达情况。研究结果1.一贯煎加减方对原发性干燥综合征阴虚肝郁证患者疗效及B淋巴细胞影响的临床研究1.1对ESR、CRP、球蛋白、免疫球蛋白的影响:治疗12周后,治疗组血沉、C反应蛋白、球蛋白、IgG与治疗前比较有显着差异（P<0.05）,IgA、IgM与治疗前比较无显着差异（P>0.05）。对照组血沉、球蛋白、IgG与治疗前比较有显着差异（P<0.05）,C反应蛋白、IgA、IgM无显着差异（P>0.05）。治疗组治疗后与对照组治疗后比较,血沉、C反应蛋白、球蛋白、IgG、IgA、IgM均无显着差异（P>0.05）。1.2对泪流量、唾液流率的影响:治疗12周后,治疗组双眼泪流量、唾液流率与治疗前比较有显着差异（P<0.05）,对照组双眼泪流量、唾液流率与治疗前比较无显着差异（P>0.05）,治疗组治疗后与对照组治疗后比较,双眼泪流量、唾液流率有显着差异（P<0.05）。1.3对焦虑、抑郁自评量表的影响:治疗12周后,治疗组焦虑、抑郁自评量表与治疗前比较有显着差异（P<0.05）,对照组焦虑、抑郁自评量表与治疗前比较无显着差异（P>0.05）,治疗组治疗后与对照组治疗后比较,焦虑、抑郁自评量表有显着差异（P<0.05）。1.4对外周血B细胞活化的影响:治疗前,与健康对照者比较,治疗组和对照组外周血B细胞活化率均显着增加,差异具有统计学意义（P均<0.05）;与治疗前比较,治疗后,治疗组和对照组外周血B细胞活化率均显着降低,差异具有统计学意义（P均<0.05）;但治疗组和对照组外周血B细胞活化率组间差异无统计学意义（P>0.05）。1.5对外周血B细胞分化的影响:治疗前,与健康对照者比较,治疗组和对照组外周血B细胞分化（分化为记忆B细胞）率显着降低,差异具有统计学意义（P均<0.05）;与治疗前比较,治疗后,治疗组和对照组外周血B细胞分化率均显着提升,差异具有统计学意义（P均<0.05）;但治疗组和对照组外周血B细胞分化率组间差异无统计学意义（P>0.05）。1.6对外周血Tfh细胞比率的影响:治疗前,与健康对照者比较,对照组和对照组外周血Tfh细胞比率（Q2象限）显着升高,差异具有统计学意义（P均<0.05）;与治疗前比较,治疗后,治疗组和对照组外周血Tfh细胞比率均显着降低,差异具有统计学意义（P均<0.05）;但治疗组和对照组外周血Tfh细胞比率组间差异无统计学意义（P>0.05）。1.7对外周血B细胞增殖的影响:治疗前,与健康对照者比较,治疗组和对照组外周血B细胞增殖率显着升高,差异具有统计学意义（P均<0.05）;与治疗前比较,治疗后,治疗组和对照组外周血B细胞增殖率均显着降低,差异具有统计学意义（P均<0.05）;但治疗组和对照组外周血B细胞增殖率组间差异无统计学意义（P>0.05）。1.8对外周血B细胞凋亡的影响:治疗前,与健康对照者比较,治疗组和对照组外周血B细胞凋亡率显着升高,差异具有统计学意义（P均<0.05）;与治疗前比较,治疗后,治疗组和对照组外周血B细胞凋亡率均显着降低,差异具有统计学意义（P均<0.05）;但治疗组和对照组外周血B细胞凋亡率组间差异无统计学意义（P>0.05）。1.9对血清细胞因子的影响:治疗前,与健康对照者比较,治疗组和对照组血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-27、IFN-γ等炎症细胞因子水平均显着增加,差异具有统计学意义（P均<0.05）;与治疗前比较,治疗后,治疗组和对照组血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-27、IFN-γ等炎症细胞因子水平均显着降低,差异具有统计学意义（P均<0.05）;但治疗组和对照组上述指标的组间差异均无统计学意义（P均>0.05）。2.一贯煎加减方对NOD小鼠B淋巴细胞的影响2.1对NOD小鼠饮水量、唾液流量、脾脏指数、颌下腺指数的影响:与空白组相比,NOD小鼠饮水量增加,唾液流量减少,脾脏指数、颌下腺指数基本相同。2.2对外周血B细胞活化的影响:与空白组比较,模型组外周血B细胞活化率显着增加差异具有统计学意义（P<0.05）,与模型组比较,低浓度复方药组、中浓度复方药组、高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组外周血B细胞活化率均有降低,其中低浓度复方药组差异无统计学意义（P>0.05）,中浓度复方药组、高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组差异均具有统计学意义（P均<0.05）。2.3对外周血B细胞分化的影响:与空白组比较,模型组外周血B细胞分化（分化为记忆B细胞）率显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较,低浓度复方药组、中浓度复方药组、高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组外周血B细胞分化率均有所提升,其中低浓度复方药组、中浓度复方药组、雷公藤组无统计学差异（P均>0.05）;高浓度复方药组、羟氯喹组差异具有统计学意义（P均<0.05）。2.4对外周血Tfh细胞比率的影响:与空白组比较,模型组外周血Tfh细胞比率（Q2象限）显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较,低浓度复方药组、中浓度复方药组、高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组外周血Tfh细胞比率均有所降低,其中低浓度复方药组、中浓度复方药组、雷公藤组差异无统计学意义（P均>0.05）;高浓度复方药组、羟氯喹组差异具有统计学意义（P均<0.05）。2.5对外周血B细胞增殖的影响:与空白组比较,模型组外周血B细胞增殖率显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较,低浓度复方药组、中浓度复方药组、高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组外周血B细胞增殖率均有所降低,其中低浓度复方药组、中浓度复方药组无统计学意义（P均>0.05）,高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组差异有统计学意义（P均<0.05）。2.6对外周血B细胞凋亡的影响:与空白组比较,模型组外周血B细胞凋亡率显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较,低浓度复方药组、中浓度复方药组、高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组外周血B细胞凋亡率均有所下降,其中低浓度复方药组、中浓度复方药组无统计学差异（P均>0.05）;高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组差异具有统计学意义（P均<0.05）。2.7对血清细胞因子的影响:与空白组比较,模型组BAFF、IFN-γ、IgG、IL-4、IL-6、IL-10、IL-27水平明显升高,差异有统计学意义（P均<0.05）;与模型组比较,低浓度复方药组、中浓度复方药组、高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组上述指标均有所下降,其中低浓度复方药组 BAFF、IFN-γ、IgG、IL-4、IL-6、IL-10、IL-27 水平无统计学差异（P 均>0.05）;中浓度复方药组IL-4水平无统计学差异（P>0.05）,BAFF、IFN-γ、IgG、IL-6、IL-10、IL-27水平有统计学差异（P均<0.05）;高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组BAFF、IFN-γ、IgG、IL-4、IL-6、IL-10、IL-27 水平均有统计学差异（P 均<0.05）。3·雷公藤甲素（TP）通过JAK/STAT和NF-κB信号通路减轻NOD小鼠唾液腺损伤的研究3.1 TP对NOD小鼠唾液腺指数、脾脏指数和唾液流量的保护作用:TP组NOD小鼠唾液腺指数显着高于对照组,脾脏指数明显低于对照组。对照组NOD小鼠唾液流量随时间延长而降低。第6～12周唾液流速明显低于TP组。随着TP浓度的增加,唾液流速与对照组相比差异较大。3.2 TP抑制NOD小鼠自身免疫损伤:TP治疗组有少量淋巴细胞浸润,无淋巴结形成。组织病理学评分分别为2.4±0.18、1.8±0.17和1.5±0.19。与对照组相比,TP治疗组NOD小鼠血清中IgG、IgM、IL-2、IL-6和TNF-α抗体水平显着降低。CD4+、CD8+和B220+/CD45+细胞显着减少。与0.05%二甲基亚砜相比,TP处理的NOD小鼠脾脏中T细胞和B细胞的增殖显着降低。3.3 TP抑制NOD小鼠唾液腺JAK/STAT和NF-κB信号通路:Western blot结果显示,TP通过抑制JAK1/2和STAT的磷酸化显着抑制JAK/STAT信号通路;通过抑制p65和Iκ Bα的磷酸化显着抑制NF-κB信号通路。3.4 TP通过抑制JAK/STAT和NF-κB信号通路降低IFN-γ诱导的唾液腺上皮细胞炎症损伤:10ng/ml、20ng/ml和40ng/ml的TP处理72h后,细胞活性无明显变化。TP显着抑制炎症因子的表达。TP对JAK1/2、STAT3、IκBα、NF-κB的表达水平无明显影响,但p-JAK1/2、p-STAT3、p-IκBα 和 p-NF-κB被显着抑制（p<0.001）。结论1.一贯煎加减方对原发性干燥综合征阴虚肝郁证患者疗效及B淋巴细胞影响的临床研究1.1与健康人相比,pSS患者B细胞活化、增殖、凋亡明显增加,记忆B细胞减少,Tfh细胞比率明显增高,经过治疗后B细胞活化数量减少,增殖水平下降,凋亡减少,记忆B细胞增多,浆细胞减少,血Tfh细胞比率降低。1.2pSS患者血清中IL-4、IL-6、IL-10、IL-27、IFN-γ细胞因子水平增加,经治疗后IL-4、IL-6、IL-10、IL-27、IFN-γ细胞因子水平降低。1.3一贯煎加减方能降低pSS患者血沉、C反应蛋白、球蛋白、IgG指数,对B淋巴细胞有调节作用,与羟氯喹相比未见明显统计学差异,但在改善患者干燥症状及情绪方面显示出了较好疗效。为一贯煎加减方治疗原发性干燥综合征阴虚肝郁证患者提供了较好的理论基础。2.一贯煎加减方对NOD小鼠B淋巴细胞的影响2.1与空白组相比,NOD小鼠饮水量增加,唾液流量减少,脾脏指数、颌下腺指数基本相同。2.2 NOD小鼠外周血B细胞活化率、外周血Tfh细胞比率、外周血B细胞增殖率、外周血B细胞凋亡率显着增加,外周血B细胞分化（分化为记忆B细胞）率显着降低,BAFF、IFN-γ、IgG、IL-4、IL-6、IL-10、IL-27 水平明显升高。2.3低、中、高不同浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组外周血B细胞活化率、外周血Tfh细胞比率、外周血B细胞增殖率、外周血B细胞凋亡率均有所降低,外周血B细胞分化率均有所提升,BAFF、IFN-γ、IgG、IL-4、IL-6、IL-10、IL-27水平亦有所下降。其中高浓度复方组、雷公藤组、羟氯喹组显示出了较好的疗效。3.雷公藤甲素（TP）通过JAK/STAT和NF-κB信号通路减轻NOD小鼠唾液腺损伤的研究3.1随着年龄的增长,对照组NOD小鼠的唾液流量逐渐降低,唾液腺内出现更严重的淋巴细胞浸润性病变。小鼠血清中IgG和IgM浓度逐渐升高,炎症因子表达增加。3.2与对照组相比,TP治疗组明显改善了唾液腺流速,减少了淋巴细胞浸润,IgG和IgM浓度及炎性因子的表达。TP抑制了T、B淋巴细胞增殖,改善NOD小鼠干燥症状,且没有明显的组织损伤。3.3 TP通过抑制JAK/STAT途径和NF-κB途径,减轻NOD小鼠的炎症反应和组织损伤。
柳颖[3]（2020）在《杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制》文中指出目前,农药残留问题仍然是食品安全领域的焦点问题,迫切需要建立快速、可靠的残留分析方法。免疫分析方法以其灵敏度高、检测迅速、易操作等特点,在快速诊断领域占有巨大市场。杂交瘤细胞作为制备免疫分析法的核心元件单抗的主要工程细胞,具有制备技术成熟、抗体表达量多、抗体特异性高等优势。本研究对体外培养条件下,杂交瘤细胞表达农药特异性抗体及其调控机制进行探究,为提高杂交瘤细胞的稳定性以及抗体表达量提供理论基础。研究内容与结果:（1）以百菌清（BJQ）特异性杂交瘤细胞为研究对象,表征了培养过程中出现不分泌特异性抗体的转阴现象,表现为增殖加快、不表达抗体轻链和/或重链蛋白,并对抗体基因及其转录表达进行比对分析,发现阴性细胞特异性抗体基因序列丢失或未丢失但表达量显着下调。（2）选择BJQ抗体基因表达量显着下调的对数生长期的D4细胞株与阳性细胞株E2进行转录组比较分析,发现D4癌基因Pet2上调,抑癌基因Lrig1下调;RNAi验证发现与囊泡转运相关基因Vapa、浆细胞分化关键因子Prdm1以及转录因子Foxb1与抗体表达显着相关。（3）利用CRISPR library对百菌清杂交瘤细胞进行全基因组基因编辑,利用农药压力筛选和流式分选方式对CRISPR敲除细胞文库进行抗体表达升高和降低的全生长周期细胞筛选,对富集的功能基因进行分析和归纳:调控杂交瘤细胞抗体表达的主要“油门”基因为抑癌基因Hivep3、Lrig1,MAPK通路基因Grap、Kras,转录调控因子Cebpb、Foxb1、Prdm1、Prdm2、Pax5,囊泡转运相关蛋白Rab12、Vapa、Vapb;主要“刹车”基因为促癌基因Pet2、Rad51、Rad50、Wnt2、Relb,抑制凋亡的基因Ucp2、Perp,促进周期进程的基因cdc25b、Id1、Plk2、Cdkl2,细胞周期进程中的周期蛋白和激酶,胞间信号传导相关的基因Rabgef1,MAPK及上游受体通路基因Rgs4、Gapt、Ralb、Rasef,PI3k/Akt通路中的基因Akt3。其中Foxb1、Prdm1、Vapa为si RNA干扰验证基因,与抗体表达成显着正向关,Pet2、Ccnd2为sh RNA干扰验证基因,与抗体表达呈显着负相关;并通过Erk/MAPK信号通路调控细胞周期和抗体基因表达。（4）对百菌清免疫各阶段的小鼠脾脏细胞进行转录组分析,发现百菌清刺激后,B细胞激活、增殖和分化为浆细胞的过程主要通过BCR级联的Ras-Erk/MAPK信号通路,启动细胞生长及抗体基因表达,与杂交瘤细胞主要通路一致。（5）对杂交瘤细胞抗体表达及调控机制进行归纳:杂交瘤细胞融合了B细胞表达特异性抗体的基因功能及SP2/0细胞不断增殖分裂的功能,在体外培养阶段两者同步进行并互相制约,通过Erk/MAPK通路及上下游相关调控因子进行细胞生长及抗体表达的调控;平台生长期细胞增殖的抑制可以促进抗体的表达,而因基因突变导致的细胞增殖异常加快会抑制抗体的表达。本研究表征了杂交瘤细胞抗体基因及其表达的多样性,探讨了百菌清特异性杂交瘤细胞抗体的表达及调控机制,明确了主要关键调控因子和信号通路,该研究为进一步提高杂交瘤细胞特异性抗体表达的稳定性及产量提供一定的理论基础。
李茜[4]（2020）在《玉米赤霉烯酮对小鼠B淋巴细胞体外活化的影响及机制研究》文中研究表明玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEA）是一种由镰刀菌属真菌产生的具有雌激素效应的霉菌毒素,普遍存在于全球各地被污染的谷物及谷物产品中,具有生殖、内分泌、免疫等多种毒性作用,甚至可导致肿瘤的发生,严重影响动物和人类的健康。近年来,玉米赤霉烯酮免疫毒性导致的动物疾病抵抗力下降、传染病易感性升高等现象越来越受到人们的重视,但相关分子机制尚未完全探明。本试验以小鼠脾脏B淋巴细胞为研究对象,通过体外试验研究了 ZEA对体液免疫中起关键作用的B淋巴细胞增殖活化、分泌功能和相关信号通路的影响,旨在揭示ZEA对动物免疫功能影响的机制。1.ZEA对小鼠B淋巴细胞活性及增殖的影响使用免疫磁珠阴性分选法从6-8周龄Balb/c小鼠脾脏中获取原代脾脏B淋巴细胞,以 0（对照组）,0.1,1.0,2.5,5.0,10μg/mL 的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）分别处理B淋巴细胞24 h,48h,CCK-8法检测LPS激活脾脏B淋巴细胞的效果,筛选合适的活化剂浓度;以0（对照组）,5,10,20,40,80μmol/L的ZEA分别处理未添加/添加活化剂LPS（5μg/mL）的B淋巴细胞24h,CCK-8法检测ZEA对脾脏B淋巴细胞活性和增殖的影响。结果显示,24 h时5 μg/mL LPS刺激小鼠脾脏B淋巴细胞活性显着上升（p<0.05）。ZEA染毒未活化的B淋巴细胞浓度达到80 μmol/L时致B淋巴细胞活性显着下降（P<0.05）。添加LPS的ZEA染毒试验中,24 h时20 μmol/L ZEA处理组细胞活性显着低于对照组（p<0.05）,40、80μmol/LZEA处理组细胞活性极显着低于对照组（p<0.01）;48 h时10μmol/L ZEA处理组细胞活性较对照组显着下降（p<0.05）,20、40、80μmol/LZEA处理组细胞活性极显着低于对照组（p<0.01）,呈剂量-效应依赖关系。结果说明,LPS能够刺激小鼠脾脏B淋巴细胞活化增殖,ZEA对小鼠B淋巴细胞有毒性作用,ZEA可以抑制小鼠B淋巴细胞增殖活化的能力。2.ZEA对小鼠B淋巴细胞活化分泌功能的影响以分选的小鼠脾脏B淋巴细胞为材料,设立空白对照组（不含LPS）、LPS（5μg/mL）对照组、ZEA（20 μmol/L）+LPS（5 μg/mL）处理组、ZEA（40 μmol/L）+LPS（5 μg/mL）处理组共四组,染毒处理24 h后,利用流式细胞术检测B淋巴细胞表面抗原CD40、CD80、CD86的表达水平,流式液相多重蛋白定量技术检测细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α的分泌水平;利用ELISA试剂盒法检测细胞培养上清液中抗体IgG,IgM的表达水平。结果显示,与空白对照组比较,LPS对照组CD40、CD80表达量均显着升高（p<0.05）,CD86表达量极显着升高（p<0.01）;与LPS对照组比较,随着ZEA染毒浓度的升高,各染毒组CD40、CD80的分泌量呈现下降趋势,40μmol/L ZEA处理组CD40和CD80的表达量显着降低（p<0.05）,CD86的表达量变化不明显（p>0.05）。与空白对照组相比,LPS对照组IL-6、IL-10、TNF-α的分泌量均有极显着上升（p<0.01）;与LPS对照组比较,各浓度ZEA处理组IL-6、IL-10、TNF-α的分泌量均极显着下降（p<0.01）,且呈剂量-效应依赖关系。与空白对照组相比,LPS对照组抗体IgG分泌量极显着升高（p<0.01）;与LPS对照组比较,随着ZEA染毒浓度的升高,染毒组IgG的分泌量呈下降趋势,20 μmol/LZEA处理组IgG分泌量较LPS对照组显着降低（p<0.05）,40μmol/L ZEA处理组IgG分泌量较LPS对照组极显着降低（p<0.01）。与空白对照组相比,LPS对照组抗体IgM分泌量显着升高（P<0.05）;与LPS对照组比较,ZEA处理组IgM分泌量变化不明显（p>0.05）。结果说明,ZEA可以减少B淋巴细胞表面抗原的表达量,抑制B淋巴细胞有关细胞因子的表达,降低B淋巴细胞分泌相关抗体的能力。3.ZEA对小鼠B淋巴细胞活化相关信号通路的影响以分选的小鼠脾脏B淋巴细胞为材料,设立空白对照组（不含LPS）、LPS（5 μg/mL）对照组、ZEA（20μmol/L）+LPS（5 μg/mL）处理组、ZEA（40 μmol/L）+LPS（5μg/mL）处理组,共同处理24 h后,利用western blot方法检测细胞凋亡信号通路相关蛋白JNK、ERK1/2、P38和NF-κB表达水平的变化情况。结果显示,与空白对照组相比,LPS对照组JNK、ERK1/2、P38和NF-κB蛋白表达量均上升,其中NF-κB蛋白表达量呈显着性升高（p<0.05）。与LPS对照组比较,20 μmol/LZEA处理组J-NK蛋白表达量升高显着（p<0.05）,40μmol/LZEA处理组升高极显着（p<0.01）;各染毒处理组ERK1/2蛋白表达量均升高（p<0.05）;40 μmol/LZEA处理组P38蛋白和NF-κB蛋白表达量均显着性下降（p<0.05）。结果说明,ZEA能够激活JNK、ERK通路蛋白的表达,抑制P38、NF-κB通路蛋白的表达。结论:ZEA可通过抑制多种细胞因子分泌、抗体的分泌和细胞表面抗原的表达,同时干扰维持细胞正常功能的相关通路关键蛋白表达等途径,影响小鼠体液免疫中B淋巴细胞的活化,影响B淋巴细胞正常功能的发挥,致使动物机体发生免疫抑制。
刘莎[5]（2020）在《弥漫性大B细胞淋巴瘤患者化疗前后免疫功能变化的临床意义》文中研究说明目的:探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell Lymphoma,DLBCL）患者化疗前后外周血中T淋巴细胞亚群、NK细胞、B淋巴细胞及免疫球蛋白的水平变化与疾病的发生、发展、治疗效果的关系。方法:选取2016年1月到2019年10月在右江民族医学院附属医院经病理确诊为弥漫性大B细胞淋巴瘤的初治患者60例为研究组,同期健康体检者60名为对照组,采用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值）、NK细胞和B淋巴细胞（CD19+）水平,采用全自动生化分析仪检测免疫球蛋白（Ig G、Ig A、Ig M）的表达水平,分析对照组与研究组化疗前后外周血中T淋巴细胞亚群、NK细胞、B淋巴细胞及免疫球蛋白的表达水平变化的临床意义。结果:（1）DLBCL患者化疗前外周血T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值）及NK细胞水平均显着低于对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）,而CD8+表达水平则显着高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;B淋巴细胞CD19+及Ig A、Ig G表达水平较对照组稍下降,Ig M表达水平较对照组稍升高,差异均无统计学意义（P>0.05）。（2）DLBCL患者化疗后外周血中T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值）及NK细胞表达水平均较化疗前上升,差异均有统计学意义（P<0.05）,CD8+水平较化疗前下降,差异有统计学意义（P<0.05）;B淋巴细胞CD19+及Ig A、Ig G、Ig M表达水平较化疗前稍升高,差异均无统计学意义（P>0.05）。（3）DLBCL患者化疗有效者化疗后外周血中T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值）及NK细胞水平均较化疗前显着上升,差异均有统计学意义（P<0.05）,CD8+水平则显着下降,差异有统计学意义（P<0.05）;B淋巴细胞CD19+及Ig A、Ig G、Ig M表达水平均较前稍上升,差异均无统计学意义（P>0.05）。（4）DLBCL患者化疗无效者化疗后外周血中T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值）及NK细胞水平较化疗前略有上升,差异均无统计学意义（P>0.05）,CD8+水平较前略下降,差异无统计学意义（P>0.05）;B淋巴细胞CD19+及Ig A、Ig G、Ig M水平较前略有上升,差异均无统计学意义（P>0.05）。（5）DLBCL患者化疗前,化疗有效者T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值）及NK细胞表达水平均高于化疗无效组,差异均有统计学意义（P<0.05）,CD8+水平低于化疗无效组,差异有统计学意义（P<0.05）;B淋巴细胞CD19+及Ig A、Ig G、Ig M表达水平稍高于化疗无效组,差异均无统计学意义（P>0.05）。（6）DLBCL患者化疗后,化疗有效组T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值）及NK细胞表达水平明显高于较化疗无效组,差异均有统计学意义（P<0.05）,CD8+水平则明显低于化疗无效组,差异有统计学意义（P<0.05）;B淋巴细胞CD19+及Ig A、Ig G、Ig M表达水平略高于化疗无效组,差异均无统计学意义（P>0.05）。（7）与对照组相比,DLBCL患者化疗有效者化疗后外周血中T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值）及NK细胞水平虽较化疗前升高,但仍低于对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）,CD8+水平虽较化疗前降低,但仍高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;B淋巴细胞CD19+细胞及Ig A、Ig G、Ig M水平略高于对照组,但差异无统计学意义（P>0.05）。（8）与对照组相比,DLBCL患者化疗无效者化疗后外周血中T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值）及NK细胞水平均明显低于对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）;CD8+水平显着高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;B淋巴细胞CD19+及Ig A、Ig G水平略低于对照组,Ig M水平略高于对照组,差异均无统计学意义（P>0.05）。结论:（1）DLBCL患者体内存在免疫抑制,以细胞免疫抑制为主,与体液免疫关系不确切。（2）外周血中T淋巴细胞亚群、NK细胞的表达水平与DLBCL发生、发展及临床疗效密切相关。动态监测DLBCL患者外周血T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）及NK细胞水平可作为DLBCL患者免疫功能监测、监测病情及判断预后的指标之一。
陈金水[6]（2020）在《脱细胞基质生物材料DNA去除标准和免疫原性研究》文中进行了进一步梳理研究目的:本研究通过不同脱细胞方法制备不同梯度DNA、脂质以及内毒素残留量的ACTM生物材料,深入比较不同DNA、脂质和内毒素残留量与ACTM生物材料体外免疫原性、体内宿主免疫应答、材料重塑和组织再生的相关性,对ACTM生物材料中残留DNA、脂质、内毒素等可能致免疫原性的因素进行分析,确认ACTM生物材料免疫原性的关键因素,建立新的DNA残留标准,为规范脱细胞技术制备ACTM生物材料提供新的方向和标准。因此本研究分为三个部分进行:1.不同DNA/脂质/内毒素残留量ACTM生物材料制备和测定;2.不同DNA/脂质/内毒素残留量ACTM生物材料体外及体内免疫原性实验;3.不同DNA/脂质/内毒素残留量ACTM生物材料大鼠部分腹壁肌缺损修复实验。研究方法:1.不同DNA/脂质/内毒素残留量ACTM生物材料制备和测定:（1）利用猪SIS和UBM材料采用梯度递进的脱细胞方法制备出不同梯度DNA、脂质、内毒素残留量的ACTM生物材料:PAA处理SIS制备SIS-1组材料;PAA+脱脂处理SIS制备SIS-2组材料;PAA+脱脂+去内毒素处理SIS制备SIS-3组材料;PAA处理UBM制备UBM组材料;以未做脱细胞处理SIS作为阳性对照SIS-PC组;以强酸强碱过度脱细胞处理SIS作为阴性对照SIS-NC组。（2）检测各组材料的细胞成分残留、DNA、脂质、内毒素、α-Gal抗原、PAA、环氧乙烷、病毒残留等指标:HE染色观察各组材料是否有细胞核成分残留;用磁珠抽提+Picogreen法检测各组材料的DNA残留量;用索氏抽提法测定各组材料的脂肪含量;用鲎试剂并采用动态光度法（定量）和凝胶法（半定量）两种方法检测法检测材料内毒素残留量;用抑制ELISA方法进行α-Gal抗原清除率测定;用酸度计检测各组材料的PAA残留;采用气相色谱法检测材料环氧乙烷残留量;用细胞培养法验证PAA处理对各组材料的病毒灭活效果。2.不同DNA/脂质/内毒素残留量ACTM生物材料体外及体内免疫原性实验:（1）体外免疫原性实验,分别从T淋巴细胞增殖实验、B淋巴细胞增殖实验、腹腔巨噬细胞活化实验及巨噬细胞分泌炎症介质（TNF-α和NO）量等方面评价ACTM生物材料的体外免疫原性。（2）体内免疫原性实验则选择小鼠腹腔植入ACTM生物材料模型,分别评价腹腔内植入材料后外周血免疫炎性反应（包括不同白细胞种类的数量、免疫球蛋白量）、腹腔免疫炎性反应（包括腹腔液巨噬细胞数量、产生炎性细胞因子量）以及脾脏指数、脾脏细胞增殖活性（检测不同淋巴细胞亚群比例）。3.不同DNA/脂质/内毒素残留量ACTM生物材料大鼠部分腹壁肌缺损修复实验:（1）构建大鼠部分腹壁肌肉缺损模型,采用同体对照法,分别于每只大鼠两侧腹壁各造一处腹壁肌部分肌肉缺损,两侧的缺损分别用同等大小不同研究材料补片Inlay法修复;（2）术后随访观察,包括大鼠基本活动、血清肿发生、手术部位感染、腹壁膨出、死亡等;（3）观察补片皱缩情况;（4）获取组织标本行组织学检测（HE染色、Masson三色染色）、免疫组化检测（CD68、CCR7、CD206、CD3、CD19、CD4、CD8）,评价修复区域的炎症细胞浸润、巨噬细胞分型及比例、淋巴细胞分型及比例以及补片降解、再生血管、再生胶原纤维等情况。研究结果:1.研究所用各组材料均无PAA残留,环氧乙烷及病毒灭活均降低至不产生显着影响水平,组间没有明显差异。除了SIS-PC组,其余各组均无细胞核成分残留,且α-gal抗原清除率无显着差异。SIS-1组材料DNA残留、脂质含量和内毒素残留水平均显着高于SIS-2组及SIS-3组材料（p<0.001）。而SIS-2组材料DNA残留量、脂质含量与SIS-3组材料相似;UBM组内毒素残留显着低于SIS-1组和SIS-2组材料,与SIS-3组材料相似,但是DNA残留和脂质含量与SIS-1组材料没有显着差异;通过前面描述的脱细胞处理方法制备出的4组研究材料DNA残留、脂质含量、内毒素残留等指标组间差距明显,四组材料特点如下:SIS-1组材料高DNA、高脂质、高内毒素;SIS-2组材料中DNA、低脂质、中内毒素;SIS-3组材料低DNA、低脂质、低内毒素;UBM组材料高DNA、高脂质、低内毒素。2.ACTM生物材料体外免疫原性实验结果显示:SIS-1组的T、B淋巴细胞增殖率均低于SIS-2组;而TNF-α、NO释放量高于SIS-2组;与SIS-2组相比,SIS-3组在T、B淋巴细胞增殖率、巨噬细胞活化率以及分泌促炎细胞因子（TNF-α和NO）方面均显着降低。UBM组、SIS-3组均没有显着提高巨噬细胞的增殖率,SIS-1组同样没有激活巨噬细胞。但TNF-α、NO的释放量与脱细胞程度正相关,SIS-2组促炎细胞因子释放量显着高于SIS-3组,而后者与UBM组无显着性差异。3.体内免疫原性实验结果显示:SIS-1组促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ高于SIS-2组,而抗炎细胞因子IL-4和IL-10则相反;SIS-1组Th细胞比例低于SIS-2组,而CTL细胞比例则更高,SIS-1组CD4+/CD8+细胞比例显着低于SIS-2组;SIS-3组腹腔巨噬细胞总数显着低于SIS-2组,而且SIS-3组促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ分泌则显着低于SIS-2,而抗炎细胞因子IL-4和IL-10分泌则相反。4.在大鼠部分腹壁肌缺损修复实验中,术后1周,SIS-1组修复区血清肿发生率为70%（21/30）,SIS-2组修复区血清肿发生率为40%（12/30）,而SIS-PC组修复区血清肿发生率高达90%（27/30）,而SIS-3、UBM及SIS-NC组未发生。SIS-3、UBM组补片皱缩不明显,术后8周,SIS-1和SIS-2组补片皱缩显着明显高于SIS-3和UBM组,而SIS-1组补片皱缩最明显,仅剩植入面积的57.1%。SIS-1和SIS-2组修复区炎性细胞浸润程度显着高于SIS-3和UBM组。SIS-3和UBM组胶原纤维再生情况也较SIS-1和SIS-2组良好。SIS-1和SIS-2修复区的细胞浸润均以M1型巨噬细胞为主,而SIS-3和UBM组则以M2型巨噬细胞为主。SIS-1和SIS-2组修复区的M1/M2比例始终显着高于SIS-3和UBM组。SIS-3和UBM的T淋巴细胞浸润以Th为主,而SIS-1、SIS-2组均以CTL为主;术后1周、4周、8周均是SIS-1修复区的CD4+/CD8+细胞比例最低,SIS-2组其次,SIS-3和UBM组始终显着高于SIS-1和SIS-2组。研究结论:1.组织材料来源不同和脱细胞方法不同,可以影响ACTM生物材料内DNA、脂质及内毒素残留等潜在引起免疫反应因素。采用逐步递进的脱细胞方法可以制备出不同梯度DNA残留、脂质含量、内毒素残留量的SIS材料和UBM材料。2.ACTM生物材料体外免疫原性实验及腹腔植入ACTM生物材料体内免疫原性实验结果均显示,ACTM生物材料免疫原性与DNA残留、脂质含量无关,而与内毒素残留有关。3.大鼠腹壁肌修补模型评价结果进一步证实,内毒素残留是ACTM生物材料植入术后早期修复区炎症-免疫反应的主要影响因素。随着内毒素残留的降低,术后早期血清肿、补片皱缩等炎症反应发生率均可降低,而低内毒素生物材料植入体内后可诱导再生组织胶原纤维有序排列,促进修复区组织重塑。4.DNA残留、脂质含量不是影响ACTM生物材料免疫炎症反应和修复效果的关键因素,需要确认新的ACTM生物材料中DNA残留量标准。内毒素残留与ACTM生物材料的免疫原性密切相关,内毒素应作为衡量ACTM生物材料免疫原性和安全性的重要指标。创新点:国内外首先研究确认残留DNA是否为影响ACTM宿主-材料反应类型和免疫原性的关键因素,提出内毒素是宿主-材料反应类型决定因素,内毒素是ACTM免疫原性和安全性的重要指标。这对于ACTM材料脱细胞新的标准制定具有重要意义,对于今后ACTM生物材料在我国大规模生产研发和临床应用具有重要的意义。
段绍霞[7]（2020）在《脓毒症时OX40-OX40L信号通路失活抑制滤泡辅助T细胞生成并导致B淋巴细胞成熟障碍》文中研究指明背景:脓毒症是机体对严重感染的反应失控而导致危及生命的器官功能障碍,是外科重症监护室中死亡率最高的疾病。脓毒症是机体感染持续无法控制的结果,近年来,由于抗感染治疗和脏器替代支持技术（肾脏替代治疗、体外膜肺氧合等）的不断提高,脓毒症短期快速死亡率明显减少,但是,脓毒症的远期生存率还是很低。多年的研究并没有找到有效的治疗方法能直接改善机体对感染的失控反应,免疫治疗可能是脓毒症患者的曙光。脓毒症是机体免疫功能和病原体的一场战争,机体的免疫状态是影响脓毒症预后最关键的因素,尤其是难治性脓毒症。脓毒症时大量病原菌侵入机体,机体免疫系统进行杀伤和吞噬导致高热、休克等免疫功能亢进的临床表现。同时大量病原菌可通过抑制免疫细胞的生成、成熟和促进免疫细胞死亡或损害免疫细胞功能导致机体免疫细胞数量减少和/或功能障碍,导致免疫抑制。所以,促炎反应和抑炎反应在脓毒症早期就同时出现。在外科监护室中,尽管每个脓毒症患者都接受多种治疗措施来清除病原体和重塑机体免疫功能,但是免疫抑制还是广泛存在。免疫抑制是导致脓毒症不良预后的关键因素,因为它不仅导致原发感染无法控制从而加重多器官功能障碍,而且会导致继发感染,尤其是条件性致病的细菌、真菌和病毒感染。探索脓毒症免疫抑制机制,进行对应治疗是改善脓毒症预后的重要手段。在临床工作中,我们发现脓毒症患者外周血中淋巴计数较低。淋巴细胞缺乏包括T淋巴细胞缺乏和B淋巴细胞缺乏,是导致脓毒症免疫抑制主要原因。既往对脓毒症期间淋巴细胞数量减少和功能障碍的研究主要集中在T淋巴细胞,且很多研究都试图揭示相关机制,而对B淋巴细胞的研究较少。我们从回顾性临床研究入手,经过前瞻性临床研究和动物实验,揭示脓毒症时B淋巴细胞减少的机制。方法:在回顾性临床研究中,我们对比28天内生存的脓毒症患者和28天内死亡的脓毒症患者在脓毒症发生时和脓毒症发生后24小时外周血中淋巴细胞计数,用Cox回归分析脓毒症患者28天死亡危险因素;根据淋巴细胞计数将患者分组,用Kaplan-Meier分析亚组患者28天死亡率。随后,我们进行了前瞻性观察性临床研究,主要使用流式细胞分析、酶联免疫吸附法来对比28天死亡组和28天生存组B淋巴细胞及其亚群细胞的数量。最后,在动物实验中,我们使用经典的脓毒症模型（盲肠结扎穿孔模型）,使用流式细胞分析、酶联免疫吸附和细胞回输等方法,来分析脓毒症时B淋巴细胞成熟情况及影响因素。结果:回顾性临床研究纳入123例脓毒症患者,在脓毒症发生时和脓毒症发生后24小时28天内死亡的脓毒症患者外周血淋巴细胞计数较28天内生存的患者低（脓毒症发生时:0.43±0.22×109/L vs.0.55±0.27×109/L,脓毒症发生后24小时:0.40±0.25×109/L vs.0.62±0.39×109/L）。在脓毒症发生时和发生后24小时外周血中淋巴细胞计数小于0.4×109/L的患者28天死亡率较高（脓毒症发生时:Log-Rank p<0.0001,脓毒症发生后24小时:Log-Rank p<0.0001）。前瞻性观察性临床研究我们纳入40例脓毒症患者,其中28天内存活患者23例,28天内死亡患者17例。我们发现在脓毒症发生时和脓毒症发生后24小时,28天死亡的患者外周血中成熟B淋巴细胞（记忆B淋巴细胞和抗体分泌细胞）和滤泡辅助T细胞计数较28天内存活的患者低（脓毒症发生时:记忆B淋巴细胞:3.44%vs.4.48%,抗体分泌细胞:4.53%vs.6.30%,滤泡辅助T细胞:3.57%vs.4.49%;脓毒症发生后24小时:记忆B淋巴细胞:4.05%vs.7.20%,抗体分泌细胞:5.25%vs.8.78%,滤泡辅助T细胞:3.98%vs.6.15%）。但是,28天生存组和死亡组之间外周血中初始B淋巴细胞数量无明显差异,同时两组之间成熟B淋巴细胞凋亡和焦亡无明显差异。在脓毒症发生时和脓毒症发生后24小时,外周血循环的滤泡辅助T细胞与成熟B淋巴细胞计数和血浆免疫球蛋白浓度呈正相关,但是与初始B淋巴细胞计数无相关性。在动物实验中,我们发现脓毒症较重的鼠脾脏中生发中心反应障碍更加明显,造成脾脏中生发中心功能障碍的主要原因是无效治疗,回输滤泡辅助T细胞可改善脾脏生发中心障碍和脓毒症生存率,OX40-0X40L信号通路失活抑制滤泡辅助T细胞生成并导致B淋巴细胞成熟障碍,激活该信号通路可促进滤泡辅助T细胞增殖、改善生发中心反应和B淋巴细胞成熟和提高脓毒症生存率。结论:脓毒症患者B淋巴细胞成熟障碍是导致外周血B淋巴细胞计数低下的主要原因。滤泡辅助T细胞是调控脾脏生发中心反应和B淋巴细胞成熟障碍的关键因素,激活OX40-OX40L信号通路可通过促进控滤泡辅助T细胞增生而改善脾脏生发中心功能和促进B淋巴细胞的成熟,从而改善脓毒症生存率。滤泡辅助T细胞、生发中心和OX40-OX40L信号通路可成为脓毒症免疫治疗的新靶点。
吉忠忠[8]（2020）在《Setd2在造血干细胞干性维持和淋巴谱系分化中的作用及机制研究》文中指出适应性免疫系统是人类识别并抵抗外界多种抗原并得以长寿的主要保障,其主要由T、B淋巴细胞组成。T、B淋巴细胞发育早期,通过抗原受体基因中V、D、J重排产生多样化的抗原受体是免疫系统得以识别多种抗原的根本原因。V（D）J重排是由RAG1/2蛋白复合物起始的抗原受体基因的DNA重排,而在细胞中DNA缠绕由组蛋白形成核小体上进而组成染色体,因此,组蛋白特定位点氨基酸上的蛋白修饰可能会参与到V（D）J重排过程进而参与调控淋巴细胞的发育。H3K36me3是由SETD2催化产生并且在物种间高度保守的组蛋白修饰。在本论文中,我们系统的探索了小鼠Setd2以及其催化产物H3K36me3在造血系统尤其是在淋巴细胞发育中的作用。利用转基因小鼠模型我们发现在造血系统中敲除Setd2之后导致了外周血淋巴细胞比例明显地减少,并且使得骨髓中造血干细胞和淋巴祖细胞的发育异常。进一步我们发现T、B细胞在DN3和pro-B时期发生发育受阻。为了排除造血系统中其他细胞的影响我们分别在T、B细胞谱系中特异性敲除Setd2之后也发现了一致的表型。我们通过V（D）J重排分析发现Setd2缺失后导致的淋巴细胞发育异常是由于异常的V（D）J重排所导致。进一步我们利用染色质免疫共沉淀、RNA-seq、免疫印迹等实验技术探索了可能的分子机制。我们发现在Setd2缺失后导致了重组蛋白RAG1对TCRβ和Igh位点RSS的识别效率降低,并且导致了DNA损伤响应蛋白ATM的激活异常,使得重排位点DNA的双链断裂后不能被高效的修复。另外,我们分析了先天性免疫缺陷病人全外显子测序信息后发现了SETD2的突变,在体外模拟了这一类突变之后,我们发现包含病人来源突变的SETD2不能有效的催化形成H3K36me3。综上,本论文系统的阐述了Setd2在淋巴细胞V（D）J重排中的作用机制,并给临床诊断和治疗先天性免疫缺陷疾病提供了新的靶点。
方义军[9]（2020）在《免疫检查点LAG-3单抗的制备及鉴定》文中研究指明癌症是威胁人类健康的重大疾病之一,免疫系统可以识别并消除癌细胞,但会受到抑制性受体（Inhibitory receptor,IR）和配体的影响。机体在正常情况下,免疫检查点（Immune checkpoint）可以通过调节自身免疫反应的强度来维持免疫耐受,但是机体在受到肿瘤侵袭时,肿瘤细胞通过异常激活免疫检查点,抑制机体对肿瘤细胞免疫监视和清除,实现肿瘤细胞的增殖和逃逸。阻断免疫检查点的药物,可以解除肿瘤对免疫的抑制、激活或者启动机体自身的免疫功能,进而帮助患者抑制、杀伤肿瘤细胞。近年来,以PD-1（Programmed cell death protein 1）/PD-L1（Programmed cell death 1 ligand 1）为代表的免疫检查点阻断剂在市场上掀起了巨大风浪,但仍有许多处在临床试验的免疫检查点抑制剂不为我们所认知。LAG-3分子是Frédéric Triebel 1990年发现的免疫球蛋白超家族成员的一种膜蛋白,表达于多种免疫细胞亚型,包括T细胞、自然杀伤细胞（NK）、树突状细胞（DCs）、和B细胞。最新研究表明该分子可以负向调控CD8+和CD4+T细胞的增殖从而激活效应功能,是目前免疫检查点二代靶点中,临床数据较多、与PD-1联用效果明显的靶点,针对该靶点的抗体药物将来有可能成为重要的抗肿瘤药物。LAG-3与CD4具有结构上的同源性,并都与组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类结合,LAG-3凭借Domain1结构中由30个氨基酸组成的额外环亲和力远远高于CD4。本论文以LAG-3分子D1上的额外环为靶点,合成多肽作为免疫原免疫新西兰公兔。分离免疫过的兔PBMC细胞后,利用流式细胞仪分选出能够识别免疫原多肽的B淋巴细胞。利用单个B细胞克隆技术制备LAG-3兔单克隆抗体,成功调取其抗体的轻重链可变区序列,并通过同源重组的方法将调取的序列构建到抗体表达载体上,利用Expi293?真核表达系统表达纯化,最后得到8株抗体。利用ELISA检测其OD450的读值,将其拟合得到抗体的EC50,其中EC50最高为0.001224,最低为0.00002479。Western blot检测发现这8株抗体均可识别重组的人源LAG-3蛋白,部分可以识别激活后人的PBMC细胞中的LAG-3蛋白,流式细胞结果表明部分可以识别内源的LAG-3。以上结果说明目前已经筛选出亲和力高,特异性强的LAG-3兔单克隆抗体,得到该分子的单克隆抗体,对后续继续优化、人源化及临床应用的研究开发具有重要意义。
张良[10]（2020）在《WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究》文中指出第一部分WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究研究背景与目的:B细胞产生保护性抗体是机体体液免疫应答对抗病毒、细菌等微生物感染入侵的最重要机制之一,体液免疫应答形成的记忆B细胞和长寿命浆细胞是机体适应性免疫应答的核心,而该过程的产生依赖于生发中心B细胞免疫应答（Germinal Center B cell reaction）,活化的B细胞在此历经克隆增殖、体细胞超频突变、抗体类别转换、抗体亲和力成熟等过程,这些过程也需要与一类特殊的CD4辅助T细胞即滤泡辅助性T淋巴细胞（Follicular Helper T cell,Tfh）的相互作用。在急性LCMV病毒感染模型中,CD4辅助T细胞在不同的TCR信号、细胞因子、信号转导分子、核转录因子的调控下主要分化成Tfh细胞和Th1细胞,分别发挥辅助B细胞和CD8 T细胞的作用。Tfh的分化是一个多步骤的过程,涉及到DC细胞和活化T细胞间突触、TCR-MHCⅡ的相互作用,共刺激分子、细胞因子及信号转导分子对其主要转录因子BCL6的调控决定Tfh早期分化命运;早期分化的Tfh迁移至GC,在此处与GCB细胞间通过频繁的细胞接触、细胞因子、共刺激分子等相互作用进一步发育为GCTfh,在GC中Tfh和GCB间相互作用,既促进GCB免疫应答,也促进和维持GCTfh的分化和功能。急性LCMV病毒感染是研究CD4辅助T细胞分化、Tfh分化发育、生发中心B细胞免疫应答、抗体生成、Th1功能和免疫记忆的理想模型之一。Wiskott-Aldrich综合征（Wiskott-Aldrich syndrome,WAS）是一种少见的X-连锁隐性遗传性免疫缺陷病,该病由编码WAS蛋白（WASp）的WAS基因突变所致,WAS患儿易感染各种病原,包括病毒、细菌、真菌等。WASp仅在造血系统表达,是肌动蛋白多聚化和细胞骨架重塑的关键分子,通过细胞骨架依赖及非依赖途径在造血细胞分化、迁移,免疫突触形成,细胞信号传导中起重要作用,WASp缺陷可导致多种免疫细胞的功能异常,导致机体对病原体产生特异性抗体功能缺陷和细胞免疫应答缺陷。但目前WASp缺陷如何影响感染状态下CD4 T与B淋巴细胞的免疫应答的机制尚不十分清楚,本研究使用急性LCMV病毒感染WASKO小鼠为模型,探讨WASp缺陷对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响和可能的分子机制。方法:通过流式细胞术检测不同时间段急性LCMV病毒感染后WASKO和WT小鼠脾脏中CD4辅助T细胞中Th1和Tfh细胞亚群的比例、主要分化发育相关的共刺激分子、信号转导分子和主要的核转录因子,检测GCB发育、GCB亚群、GCB的主要核转录因子BCL6。利用四聚体技术检测抗原特异性Th1和Tfh细胞的比例。通过NP-KLH免疫小鼠后,检测小鼠脾脏记忆B细胞前体细胞比例,探讨抗原特异性GCB细胞的分化。通过WASKO/WT骨髓嵌合体小鼠模型验证WAS蛋白缺陷在急性LCMV病毒感染时特异性T和B细胞免疫缺陷是否为固有存在。结果:WASKO小鼠在急性LCMV病毒感染条件下CD4辅助T细胞早期分化阶段出现IL2-CD25-STAT5轴信号转导障碍导致Th1细胞发育障碍,进而Tfh分化占优势;WASp缺陷影响Tfh进一步发育的主要功能分子BCL6和ICOS,导致GCTfh的发育障碍;WASKO小鼠GCB主要的核转录因子BCL6表达障碍,GCB暗区形成障碍;GCB细胞分化异常表现为GCB分化为多克隆性记忆B细胞前体细胞比例增高而分化成多克隆性记忆B细胞存在障碍;NP-KLH免疫条件下抗原特异性GCB分化为记忆B细胞前体细胞比例增加,但分化形成抗原特异性记忆B细胞存在障碍。WT小鼠GCB细胞内WASp呈现异质性表达的现象,并且BCL6的表达量与WASp呈正相关。结论:WASp作为肌动蛋白骨架蛋白调节因子通过多种途径参与了急性LCMV病毒感染中CD4辅助T细胞的早期分化命运、Tfh的发育和GCB免疫应答和记忆B细胞形成的过程。第二部分PI3Kδ过度活化对脾脏前体B细胞发育的影响研究研究背景与目的:活化的磷酸肌醇3-激酶δ综合征（Activated phosphoinositide 3-kinaseδsyndrome APDS）是一种由PIK3CD增功能突变（gain-of-function（GOF）mutation）引起的常染色体显性遗传性原发性免疫缺陷病,该基因编码磷酸肌醇3-激酶δ（PI3Kδ）的催化亚基p110δ。PI3Kδ是包含p110δ催化亚基和p85a调控亚基的异二聚体,催化产生磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸酯,PI3Kδ主要表达在白细胞中并在其增殖生存和激活中起重要作用。APDS患者临床主要表现为反复窦肺感染、支气管扩张、良性淋巴组织增生、疱疹病毒感染以及自身免疫性疾病,其免疫表型主要为高Ig M、低Ig G、CD4 T淋巴细胞减少、衰老耗竭性CD8 T淋巴细胞增加。目前研究阐明Tfh和GCB的异常导致患者出现低Ig G,但患者出现高Ig M血症的机制尚不十分清楚。在机体边缘区B细胞（marginal zone B cell,MZB）及B1细胞是产生Ig M的主要来源,患者和小鼠模型中均发现在B细胞亚群中MZB及B1细胞比例增加和滤泡B细胞的明显减少,且增多的MZB和B1与自身免疫性疾病和肺部感染易感性相关,但p110δ过度活化如何导致MZB和B1细胞增加的机制尚不清楚。早期B细胞在骨髓发育后进入脾脏进一步发育分化成熟,逐渐经历过渡性B细胞T1、T2阶段分化为成熟的滤泡B细胞和MZB,目前的研究表明在更早的T1B阶段即存在ADAM10阳性的细胞亚群为专职发育成MZB的前体细胞以及CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+的过渡性B细胞为专职发育成B1的前体细胞。本实验拟通过检测APDS小鼠脾脏前体B细胞亚群,探讨PI3Kδ过度活化是否在过渡性B细胞阶段即影响了专职的MZB前体细胞和B1前体细胞的分化进而导致B细胞的分化发育异常。方法:通过流式细胞术检测APDS小鼠和WT小鼠脾脏T1B、T2B、CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+B、ADAM10+T1B等B细胞各亚群的比例。通过APDS/WT骨髓嵌合体小鼠模型验证B细胞各亚群的发育分化异常是否为固有存在。结果:与WT小鼠相比,APDS小鼠脾脏成熟滤泡B细胞比例下降,CD19+B220+CD21+CD23-CD93-和CD19+B220+CD21+CD1d+CD93-MZB增加,CD19+B220low CD5+B1细胞增加,CD19+B220+CD21-CD23-CD93-的双阴性B细胞比例增加;APDS小鼠CD19+B220+Ig M+CD23-CD93+的T1B细胞比例增加,CD19+B220+Ig M+CD23+CD93+的T2B细胞比例下降;APDS小鼠脾脏B1细胞前体细胞CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+、MZB前体细胞ADAM10+T1B细胞亚群比例增高。结论:PI3K过度活化通过影响T1B细胞ADAM10的表达使得在T1B细胞阶段专职的MZB前体细胞分化增加是APDS小鼠MZB细胞发育增加而成熟滤泡B细胞发育减少的重要机制之一;PI3K过度活化在过渡性B细胞阶段导致脾脏前体细胞CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+分化增加进而导致脾脏B1细胞的发育增加。第三部分一例RAC2基因自发突变患儿临床研究研究背景:RAC2蛋白（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2,RAC2）属于GTP酶的Rho超家族的成员,其主要表达于造血系统,作为中性粒细胞NADPH组成元件参与粒细胞ROS产生、作为分子开关通过调节GTP结合状态（活化状态）与GDP结合状态（失活状态）间的相互转换促发下游级联反应发挥免疫细胞骨架重排、细胞伪足形成、吞噬细胞黏附趋化吞噬功能、T淋巴细胞和B淋巴细胞的发育、迁移、活化及参与PAK1等多种信号通路信号传导发挥多种生物信息功能。RAC2基因突变病例极其罕见,既往报道RAC2基因突变方式包括常染色体显性失功能突变方式导致中性粒细胞功能严重障碍而表现为CGD的临床症状,部分患儿表现为T淋巴细胞的严重减少;以及常染色体隐性失功能突变方式导致CVID的临床表现;这两种遗传方式导致的RAC2蛋白的表达明显下降或缺失,为失功能（loss of function,LOF）的突变。随着基因测序技术的发展和广泛应用,目前逐渐有RAC2常染色体显性增功能突变方式导致RAC2蛋白活性增强（gain of function,GOF）的病例报道,此类患儿的临床表现各异,其粒细胞ROS活性增强,T淋巴细胞和B淋巴细胞严重减低,对于T淋巴细胞和B淋巴细胞严重减低的机制目前不清楚。本中心收治1例RAC2基因自发突变的患儿,该突变位点未见报道,临床主要变现为反复的肺部感染和支气管扩张,我们对其临床和部分免疫细胞功能进行了初步研究。研究方法:分离外周血单个核淋巴细胞及中性粒细胞,进行一代测序;通过流式细胞术检测患儿淋巴细胞亚群表型;通过CD3+CD28及PMA+离子霉素体外刺激检测T淋巴细胞增殖功能;通过鲁米诺放大化学发光法检测中性粒细胞ROS的产生;通过流式细胞术检测中性粒细胞肌动蛋白的表达情况;通过共聚焦显微镜观察中性粒细胞及T淋巴细胞极化状态;通过蛋白免疫印迹检测RAC2蛋白的表达情况;通过流式细胞术检测中性粒细胞和T淋巴细胞及B淋巴细胞凋亡;通过流式细胞术检测单个核淋巴细胞亚群RAC2的表达情况。结果:患儿为RAC2基因自发错义突变,患儿单个核淋巴细胞及中性粒细胞均存在此突变,其免疫表型为联合免疫缺陷,其T细胞增殖功能减低,粒细胞产生ROS功能增强,粒细胞肌动蛋白表达增强;患儿中性粒细胞及T淋巴细胞体外刺激时细胞actin和RAC2极化状态缺陷;患儿中性粒细胞RAC2蛋白表达增强;患儿中性粒细胞和淋巴细胞凋亡增加;患儿淋巴细胞中存在RAC2高表达亚群。结论:本研究发现一例罕见的RAC2基因自发突变,表现为增功能突变,免疫表型为联合免疫缺陷,其淋巴细胞及中性粒细胞功能均受影响。
二、只有B淋巴细胞才能表达免疫球蛋白?（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、只有B淋巴细胞才能表达免疫球蛋白?（论文提纲范文）
（1）IgD-Fc-Ig融合蛋白通过抑制B细胞IgDR-Syk-Btk-NF-κB信号通路对小鼠CIA治疗作用的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 动物 |
| 2.2 细胞系 |
| 2.3 药物 |
| 2.4 试剂 |
| 2.5 溶液配制 |
| 2.6 仪器与设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 融合蛋白的提取 |
| 3.1.1 DG和IgG_1-Fc质粒的提取 |
| 3.1.2 DG和IgG1-Fc的纯化 |
| 3.1.3 BCA蛋白定量试剂盒测定融合的蛋白浓度 |
| 3.1.4 使用考马斯亮蓝染色鉴定DG和IgG1-Fc |
| 3.2 DG对CIA小鼠治疗作用的研究 |
| 3.2.1 小鼠CIA模型的制备 |
| 3.2.2 实验分组 |
| 3.2.3 给药方案 |
| 3.2.4 对各组小鼠进行全身评分 |
| 3.2.5 对各组小鼠进行关节炎指数评分 |
| 3.2.6 关节炎足爪肿胀数评分 |
| 3.2.7 记录每只小鼠体重变化情况 |
| 3.2.8 使用流式细胞术检测不同炎症阶段PBMC中B淋巴细胞亚群的百分比 |
| 3.2.9 胸腺指数和脾脏指数测定 |
| 3.2.10 CCK-8法检测T、B淋巴细胞活力 |
| 3.2.11 流式细胞术检测各组小鼠脾脏组织中B淋巴细胞亚群变化 |
| 3.2.12 H&E染色评价DG对脾脏和踝关节病理学的影响 |
| 3.2.13 CIA小鼠B淋巴细胞表面IgDR表达情况检测 |
| 3.2.14 测定IgD与小鼠CD19~+B淋巴细胞的亲和力 |
| 3.2.15 测定DG对小鼠CD19~+B淋巴细胞的亲和力 |
| 3.2.16 测定DG竞争IgD结合小鼠B淋巴细胞表面IgDR的 IC50 |
| 3.2.17 蛋白芯片技术检测小鼠血清中免疫球蛋白的水平 |
| 3.2.18 使用免疫印迹法检测小鼠脾脏组织中p-Lyn、p-Syk、p-Btk、NF-κB p65和MAPK p38水平的变化 |
| 3.2.19 使用免疫荧光技术检测p-Lyn、p-Syk、p-Btk在小鼠脾脏组织B淋巴细胞中的表达 |
| 3.2.20 使用免疫组化检测小鼠踝关节软骨和滑膜组织中MMP-13、CollagenⅡ和RANKL的表达 |
| 3.2.21 免疫荧光检测小鼠脾脏组织B淋巴细胞表面IgDR的表达和与IgD-BCR、IgM-BCR的共定位 |
| 3.3 IgD通过IgDR对BCR信号通路活化的研究 |
| 3.3.1 Ramos和Daudi细胞株的培养 |
| 3.3.2 人IgD对Daudi细胞BCR信号通路的刺激浓度的选择 |
| 3.3.3 IgD/DG对Daudi/Ramos细胞表面IgDR亲和力的测定 |
| 3.3.4 DG竞争IgD结合Daudi/Ramos细胞表面IgD受体IC50的测定 |
| 3.3.5 过表达pIRES-EGFP-Lyn质粒的构建 |
| 3.3.6 Lyn过表达质粒转染Daudi细胞 |
| 3.3.7 Lyn选择性抑制剂Bafetinib浓度的选择 |
| 3.3.8 Daudi和Ramos细胞蛋白的提取 |
| 3.3.9 免疫荧光检测DG对NF-κB p65入核和磷酸化的影响 |
| 3.3.10 Daudi细胞总mRNA的提取 |
| 3.3.11 蛋白免疫印迹法检测DG对Daudi细胞BCR信号通路关键蛋白分子的表达 |
| 3.3.12 qRT-PCR检测DG对Daudi细胞转录因子mRNA转录水平的影响 |
| 3.3.12.1 mRNA逆转录为互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA) |
| 3.3.12.2 B淋巴细胞相关转录因子引物序列 |
| 3.3.12.3 实时荧光定量PCR法检测B淋巴细胞转录因子m RNA的转录水平 |
| 3.3.13 使用单载体Cas9-U6-sgRNA(Igα+Igβ)质粒构建Igα~(-/-)Igβ~(-/-)Ramos细胞 |
| 3.3.13.1 质粒的构建 |
| 3.3.13.2 电穿孔法将质粒转染至Ramos细胞 |
| 3.3.13.3 流式分选EGFP阳性细胞 |
| 3.3.13.4 蛋白免疫印迹鉴定Igα和Igβ是否表达 |
| 3.3.14 蛋白印迹法检测IgD对Igα~(-/-)Igβ~(-/-)Ramos细胞BCR信号通路的影响 |
| 3.3.15 Cas9单载体慢病毒构建Igβ~(-/-)Ramos细胞 |
| 3.3.15.1 单载体Cas9-sgRNA质粒的构建 |
| 3.3.15.2 慢病毒的包被 |
| 3.3.15.3 Ramos细胞株复感染指数(multiplicity of infection, MOI)的校正,确定最佳感染条件 |
| 3.3.15.4 慢病毒的转染 |
| 3.3.16 蛋白免疫印迹检测IgD对Igβ~(-/-)Ramos细胞BCR信号通路的影响 |
| 3.3.17 qRT-PCR检测IgD对Igβ~(-/-)Ramos细胞转录因子mRNA水平的影响 |
| 3.4 统计结果分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 DG的纯化 |
| 4.2 IgD和DG对CIA小鼠B淋巴细胞的亲和力,DG抑制IgD与小鼠B淋巴细胞表面IgDR结合的IC50 |
| 4.3 免疫荧光检测小鼠脾脏B淋巴细胞表面IgDR的表达 |
| 4.4 DG对CIA小鼠的足爪评分、关节炎指数和体重的影响 |
| 4.5 DG对CIA小鼠不同炎症周期外周血中B淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.6 CIA小鼠B淋巴细胞表面IgDR的表达情况 |
| 4.7 DG对CIA小鼠脾脏组织中B淋巴细胞各亚群变化的影响 |
| 4.8 DG对CIA小鼠脾脏和胸腺指数的影响 |
| 4.9 DG对CIA小鼠T/B淋巴细胞活力的影响 |
| 4.10 DG对CIA小鼠脾脏病理的影响 |
| 4.11 DG对CIA小鼠踝关节病理的影响 |
| 4.12 DG对CIA小鼠踝关节软骨中MMP-13和CollagenⅡ表达的影响 |
| 4.13 DG对CIA小鼠踝关节滑膜组织MMP-13、CollagenⅡ和RANKL表达的影响 |
| 4.14 DG对CIA小鼠脾脏组织B淋巴细胞中p-Lyn、p-Btk和p-Syk表达的影响 |
| 4.15 DG对CIA小鼠血清中免疫球蛋白各亚型的影响 |
| 4.16 DG对小鼠脾脏组织中BCR信号通路关键蛋白分子水平的影响 |
| 4.17 不同浓度梯度的人IgD对Daudi细胞p-Lyn、p-Syk和p-Btk的影响 |
| 4.18 Bafetinib对Daudi细胞中Lyn表达最佳抑制浓度的选择 |
| 4.19 构建Lyn过表达质粒 |
| 4.20 IgD和DG对Daudi细胞的亲和力,DG抑制IgD与Daudi细胞表面IgDR结合的IC50 |
| 4.21 DG对IgD刺激的Daudi细胞NF-κB p65入核及磷酸化的影响 |
| 4.22 DG对IgD刺激的Daudi细胞IgD-IgDR-Syk-Btk-NF-κB信号通路关键分子的影响 |
| 4.23 DG对IgD刺激Daudi细胞转录因子水平的影响 |
| 4.24 IgD和DG对Ramos细胞的亲和力、DG抑制IgD与Raoms细胞表面IgDR结合的IC50的测定 |
| 4.25 单载体Cas9-U6-sgRNA(Igα+Igβ)质粒构建 |
| 4.26 WB鉴定IgαIgβ敲除Ramos细胞株 |
| 4.27 IgD对Igα~(-/-)Igβ~(-/-)Ramos BCR信号通路的影响 |
| 4.28 Cas9单载体慢病毒靶向Igβ构建 |
| 4.29 WB鉴定Igβ敲除Ramos细胞株 |
| 4.30 IgD对Igβ~(-/-)Ramos BCR信号通路的影响 |
| 4.31 IgD对Igβ~(-/-)Ramos细胞转录因子水平的影响 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 7.课题创新点 |
| 8.下一步工作计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述:基因多态性对类风湿关节炎药物疗效和不良反应 |
| 参考文献 |
（2）滋阴疏肝法对原发性干燥综合征B淋巴细胞的影响及雷公藤甲素对NOD小鼠唾液腺损伤的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 原发性干燥综合征中西医研究进展 |
| 1. 西医对原发性干燥综合征发病的机制研究 |
| 1.1 原发性干燥综合征患者中B淋巴细胞异常 |
| 1.2 原发性干燥综合征患者中细胞因子分泌异常 |
| 1.3 原发性干燥综合征与JAK/STAT信号通路 |
| 1.4 原发性干燥综合征与NF-κB信号通路 |
| 2. 原发性干燥综合征患者合并焦虑、抑郁者多见 |
| 2.1 原发性干燥综合征患者生活质量、焦虑抑郁情绪与疾病活动度的研究 |
| 2.2 原发性干燥综合征患者情绪障碍可能是其中枢神经系统受累的表现之一 |
| 2.3 原发性干燥综合征患者焦虑抑郁可能与机体免疫异常有关 |
| 2.4 免疫功能紊乱导致或加重情绪障碍的可能机制 |
| 3. 祖国医学认为七情失调导致和加重原发性干燥综合征 |
| 4. 从肝论治原发性干燥综合征 |
| 4.1 肝的生理病理与原发性干燥综合征发病的关系 |
| 4.2 干燥综合征局部证候表现与肝关系密切 |
| 4.3 历代医家从肝论治原发性干燥综合征 |
| 4.4 一贯煎加减方治疗原发性干燥综合征 |
| 4.5 雷公藤治疗原发性干燥综合征的研究 |
| 小结 |
| 第二部分 一贯煎加减方对原发性干燥综合征阴虚肝郁证患者疗效及B淋巴细胞影响的临床研究 |
| 1. 病例选择 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 中医辨证诊断标准 |
| 1.4 纳入标准 |
| 1.5 排除标准 |
| 1.6 剔除标准 |
| 1.7 退出标准 |
| 1.8 研究用药及给药方法 |
| 1.9 疗程与观察项目 |
| 1.10 疗效评价 |
| 1.11 伦理要求 |
| 2. 试验材料 |
| 2.1 试验取材 |
| 2.2 试验试剂和仪器 |
| 3. 试验方法及步骤 |
| 3.1 外周血单个核细胞分离 |
| 3.2 流式细胞术检测外周血B细胞活化、分化表面标记以及Tfh细胞比率 |
| 3.3 CFSE标记检测外周血B细胞增殖能力 |
| 3.4 Annexin V标记检测外周血B细胞调亡水平 |
| 3.5 IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-27检测 |
| 3.6 临床疗效观察 |
| 4. 统计学处理 |
| 5. 试验结果 |
| 5.1 一贯煎加减方对原发性干燥综合征阴虚肝郁证患者临床疗效的观察 |
| 5.2 一贯煎加减方对原发性干燥综合征阴虚肝郁证患者B淋巴细胞影响的临床研究 |
| 6. 讨论 |
| 第三部分 一贯煎加减方对NOD小鼠B淋巴细胞的实验研究 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 标本收集 |
| 2.3 饮水量测定 |
| 2.4 唾液流量测定 |
| 2.5 脾指数、颌下腺指数测定 |
| 2.6 外周血B淋巴细胞检测 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 饮水量检测 |
| 3.2 唾液流量测定 |
| 3.3 脾脏指数和颌下腺指数 |
| 3.4 唾液腺病理切片及HE染色 |
| 3.5 外周血单个核细胞分离 |
| 3.6 各组外周血B细胞活化情况 |
| 3.7 各组外周血B细胞分化情况 |
| 3.8 各组外周血Tfh细胞比率情况 |
| 3.9 各组外周血B细胞增殖情况 |
| 3.10 各组外周血B细胞凋亡情况 |
| 3.11 各组血清细胞因子及IgG水平 |
| 4. 讨论 |
| 第四部分 雷公藤甲素通过JAK/STAT和NF-κB信号通路减轻NOD小鼠唾液腺损伤的实验研究 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 治疗和分组 |
| 2.2 唾液流量的测量 |
| 2.3 唾液腺指数和脾脏指数的计算 |
| 2.4 ELISA试验 |
| 2.5 苏木精-伊红染色 |
| 2.6 流式细胞术分析小鼠唾液腺淋巴细胞分布 |
| 2.7 脾脏T细胞和B细胞增殖试验 |
| 2.8 唾液腺上皮细胞的分离培养 |
| 2.9 免疫印迹(Western blot) |
| 2.10 统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 TP对NOD小鼠唾液腺指数、脾脏指数和唾液流量的保护作用 |
| 3.2 TP抑制NOD小鼠自身免疫损伤 |
| 3.3 TP抑制NOD小鼠唾液腺JAK/STAT和NF-κB信号通路 |
| 3.4 TP通过抑制JAK/STAT和NF-κB信号通路降低IFN-γ诱导的唾液腺上皮细胞炎症损伤 |
| 4. 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一：综述 |
| 综述参考文献 |
| 附录二 |
| 附录三 |
| 主要缩略语表 |
| 攻读博士期间科研情况 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 术语与缩略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 农药残留及免疫检测技术发展现状 |
| 1.2 农药小分子特异性单克隆抗体研究进展 |
| 1.3 杂交瘤细胞技术 |
| 1.4 杂交瘤细胞识别特异性基础——B淋巴细胞 |
| 1.5 CRISPR/Cas基因编辑在杂交瘤细胞生物学研究中的应用 |
| 1.5.1 基因编辑技术概况 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas系统结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas系统机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9基因编辑原理 |
| 1.5.5 CRISPR/Cas9基因编辑文库 |
| 1.5.6 CRISPR/Cas9系统及文库在抗体基因编辑上的应用 |
| 1.6 研究内容及预期目标 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 预期目标 |
| 1.6.3 研究技术路线 |
| 第2章 杂交瘤细胞株及抗百菌清单抗表型的多样性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与设备 |
| 2.2.1.1 试剂材料 |
| 2.2.1.2 试剂盒 |
| 2.2.1.3 仪器设备 |
| 2.2.1.4 培养液及缓冲液配方 |
| 2.2.1.5 试验动物 |
| 2.2.2 农药特异性杂交瘤细胞筛选及单克隆抗体制备 |
| 2.2.2.1 动物免疫 |
| 2.2.2.2 小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)及饲养细胞的准备 |
| 2.2.2.3 细胞融合 |
| 2.2.2.4 阳性杂交瘤单克隆细胞株筛选 |
| 2.2.3 腹水单抗制备与表征 |
| 2.2.3.1 小鼠腹水单抗制备 |
| 2.2.3.2 腹水单抗灵敏度测定 |
| 2.2.3.3 腹水单抗轻重链类型测定 |
| 2.2.4 不同农药特异性杂交瘤细胞株不同处理后阴性率统计 |
| 2.2.5 杂交瘤细胞株抗体分泌FACS分析 |
| 2.2.6 阴阳性单克隆杂交瘤细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.2.7 BJQ单克隆杂交瘤细胞株抗体产生情况表征 |
| 2.2.7.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.2.7.2 BJQ杂交瘤细胞不同生长阶段Ig G分泌表征 |
| 2.2.7.3 杂交瘤细胞胞内总蛋白提取及浓度测定 |
| 2.2.7.4 胞内蛋白抗体亲和特异性检测 |
| 2.2.7.5 胞内蛋白Ig G定量 |
| 2.2.7.6 胞内蛋白抗体轻重链类型鉴定 |
| 2.2.7.7 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 阳性单克隆杂交瘤细胞株筛选及腹水单抗表征 |
| 2.3.2 单克隆杂交瘤细胞株阴性率测定 |
| 2.3.3 抗体分泌情况FACS分析 |
| 2.3.4 各农药阴阳性细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.3.5 BJQ单克隆细胞周期及抗体表达表征 |
| 2.3.5.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.3.5.2 BJQ阳性细胞株E2生长阶段与Ig G分泌 |
| 2.3.5.3 胞内蛋白的抗体特异性鉴定 |
| 2.3.5.4 胞内蛋白IgG定量 |
| 2.3.5.5 胞内蛋白抗体轻重链类型表征 |
| 2.3.5.6 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料与设备 |
| 3.2.1.1 试剂材料 |
| 3.2.1.2 仪器设备 |
| 3.2.1.3 主要缓冲液 |
| 3.2.1.4 实验材料 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞测序 |
| 3.2.2.1 杂交瘤细胞总RNA提取 |
| 3.2.2.2 5’RACE反转录及PCR扩增抗体轻重链可变区序列 |
| 3.2.2.3 抗体基因克隆及Sanger测序 |
| 3.2.3 HEK293(F)重组全抗体瞬时表达 |
| 3.2.3.1 质粒提取 |
| 3.2.3.2 瞬时表达质粒构建及验证 |
| 3.2.3.3 重组全抗体瞬时表达及纯化 |
| 3.2.3.4 瞬时表达重组抗体表征 |
| 3.2.4 HEK293重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.1 构建慢病毒表达载体 |
| 3.2.4.2 慢病毒包装及滴度测定 |
| 3.2.4.3 重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.4 稳定表达重组抗体表征 |
| 3.2.5 杂交瘤细胞株免疫组库测序及分析 |
| 3.2.6 杂交瘤细胞转录组测序及生物信息分析 |
| 3.2.6.1 转录组测序 |
| 3.2.6.2 转录组数据生物信息分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 杂交瘤细胞测序 |
| 3.3.1.1 总RNA的提取 |
| 3.3.1.2 特异性PCR产物分析 |
| 3.3.2 百菌清重组抗体瞬时表达 |
| 3.3.2.1 瞬时表达载体构建及验证 |
| 3.3.2.2 重组抗体瞬时表达及纯化表征 |
| 3.3.3 百菌清重组抗体稳定表达 |
| 3.3.3.1 不同表达质粒和表达体系稳定表达重组抗体效果表征 |
| 3.3.3.2 腹水抗体以及瞬时/稳定表达的重组抗体亲和性表征 |
| 3.3.4 BJQ杂交瘤细胞株免疫组库测序 |
| 3.3.5 BJQ阴阳性细胞转录组学测序及分析 |
| 3.3.5.1 RNA样品检测结果 |
| 3.3.5.2 测序数据过滤及测序质量分析 |
| 3.3.5.3 参考基因组比对 |
| 3.3.5.4 样品组间相关性 |
| 3.3.5.5 杂交瘤细胞株抗体基因表达分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 抗百菌清单抗表达差异的杂交瘤细胞株转录组分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料与设备 |
| 4.2.1.1 试剂材料 |
| 4.2.1.2 仪器设备 |
| 4.2.1.3 实验材料 |
| 4.2.2 转录组差异表达基因筛选及GO/KEGG富集 |
| 4.2.3 qPCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.2.3.1 RNA提取 |
| 4.2.3.2 cDNA合成 |
| 4.2.3.3 qPCR反应 |
| 4.2.4 RNA干扰 |
| 4.2.4.1 基因siRNA片段设计 |
| 4.2.4.2 siRNA转染条件优化 |
| 4.2.4.3 RNA基因干扰 |
| 4.2.4.4 qPCR验证RNAi效果 |
| 4.2.4.5 流式分析RNAi杂交瘤细胞抗体分泌情况 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 差异表达基因分析 |
| 4.3.2 差异基因GO富集分析 |
| 4.3.3 差异基因KEGG富集分析 |
| 4.3.4 显着差异表达基因分析 |
| 4.3.5 qPCR验证转录组数据 |
| 4.3.6 RNAi验证基因功能 |
| 4.3.6.1 siRNA转染效率优化 |
| 4.3.6.2 RNA干扰功能基因表达及抗体分泌 |
| 4.3.7 杂交瘤细胞抗体表达途径及转阴可能因素 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第5章 CRISPR/Cas9文库筛选杂交瘤细胞抗体表达的功能基因 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.2.3 文库质粒扩增 |
| 5.2.4 慢病毒包装 |
| 5.2.4.1 去内毒素质粒中提 |
| 5.2.4.2 慢病毒包装 |
| 5.2.4.3 慢病毒滴度测定 |
| 5.2.5 杂交瘤细胞慢病毒文库感染 |
| 5.2.5.1 细胞准备 |
| 5.2.5.2 嘌呤霉素筛选浓度优化 |
| 5.2.5.3 慢病毒感染效率测定 |
| 5.2.6 GeCKO慢病毒文库感染E2细胞株 |
| 5.2.7 农药压力筛选 |
| 5.2.7.1 筛选原理 |
| 5.2.7.2 百菌清农药对杂交瘤细胞致死效应及抗体“中和作用” |
| 5.2.7.3 百菌清农药筛选浓度优化 |
| 5.2.7.4 百菌清农药筛选GeCKOv2E2细胞文库 |
| 5.2.8 流式细胞分选 |
| 5.2.8.1 分选原理 |
| 5.2.8.2 流式细胞分选 |
| 5.2.9 NGS扩增子测序 |
| 5.2.9.1 基因组DNA提取 |
| 5.2.9.2 特异性PCR |
| 5.2.9.3 NGS扩增子测序及数据分析 |
| 5.2.10 sh RNA功能基因验证 |
| 5.2.10.1 shRNA慢病毒质粒构建及慢病毒包装 |
| 5.2.10.2 shRNA慢病毒感染 |
| 5.2.10.3 qPCR验证基因功能 |
| 5.2.10.4 FACS检测杂交瘤细胞抗体表达情况 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 GeCKOv2 library质粒扩增 |
| 5.3.2 GeCKO library慢病毒包装与检测 |
| 5.3.3 杂交瘤细胞慢病毒文库构建 |
| 5.3.3.1 puro筛选浓度优化 |
| 5.3.3.2 慢病毒感染效率测定 |
| 5.3.3.3 GeCKOv2 E2 library慢病毒敲除文库构建 |
| 5.3.4 百菌清农药压力筛选 |
| 5.3.4.1 百菌清农药对杂交瘤细胞的毒性作用 |
| 5.3.4.2 特异性单抗对百菌清农药的“中和作用” |
| 5.3.4.3 百菌清农药筛选时间及浓度优化 |
| 5.3.4.4 百菌清农药筛选GeCKO v2 E2细胞文库 |
| 5.3.5 流式细胞分选 |
| 5.3.6 农药压力筛选NGS扩增子测序分析 |
| 5.3.6.1 核酸样品质控 |
| 5.3.6.2 测序数据质控 |
| 5.3.6.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.6.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.6.5 样品间相似性分析 |
| 5.3.6.6 显着富集基因分析 |
| 5.3.6.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.6.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.6.9 药筛富集的功能基因、通路与转录组比对分析 |
| 5.3.7 流式细胞分选测序结果分析 |
| 5.3.7.1 核酸样品质控 |
| 5.3.7.2 测序数据质控 |
| 5.3.7.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.7.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.7.5 样本间相似性分析 |
| 5.3.7.6 显着差异基因分析 |
| 5.3.7.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.7.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.7.9 CRISPR library流式筛选及药物筛选功能基因通路与RNA-seq比对分析 |
| 5.3.8 shRNA干扰验证功能基因 |
| 5.3.8.1 shRNA慢病毒感染效率优化 |
| 5.3.8.2 qPCR验证干扰基因及抗体基因表达情况 |
| 5.3.8.3 FACS检测抗体表达情况 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第6章 百菌清抗原免疫小鼠脾脏细胞转录组学分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 转录组测序与生物信息分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 脾脏转录组RNA样品检测结果 |
| 6.3.2 脾脏转录组测序数据过滤及测序质量分析 |
| 6.3.3 脾脏转录组数据参考基因组比对 |
| 6.3.4 基因表达分析及显着性DEG筛选 |
| 6.3.5 差异基因GO富集分析 |
| 6.3.6 差异基因KEGG富集分析 |
| 6.3.7 显着差异基因分析 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 第7章 抗百菌清杂交瘤细胞抗体表达的调控途径及分子机制探究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 BJQ特异性杂交瘤细胞株及其单抗的多样性分析 |
| 7.2.1 杂交瘤细胞株及其单抗表型的多样性分析 |
| 7.2.1.1 阴阳性单克隆杂交瘤细胞的定义 |
| 7.2.1.2 不同处理方式测定杂交瘤细胞株阴性率 |
| 7.2.1.3 杂交瘤细胞增殖及抗体分泌情况 |
| 7.2.1.4 流式分析杂交瘤细胞抗体分泌情况及抗体亚型检测 |
| 7.2.1.5 BJQ杂交瘤细胞株抗体产生情况分析 |
| 7.2.2 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 7.2.2.1 BJQ特异性杂交瘤细胞抗体序列测定及验证 |
| 7.2.2.2 BJQ阴阳性细胞及SP2/0 细胞免疫组库测序 |
| 7.2.2.3 BJQ五株阴阳性细胞及SP2/0 细胞抗体基因表达情况 |
| 7.3 BJQ特异性抗体表达差异的杂交瘤细胞株转录组学分析 |
| 7.3.1 DEG筛选及RNA-seq可靠性验证 |
| 7.3.2 GO功能及KEGG通路富集分析 |
| 7.3.3 差异表达基因分析 |
| 7.3.4 RNAi相关功能基因分析 |
| 7.4 CRISPR文库筛选杂交瘤细胞抗体表达相关基因及通路分析 |
| 7.4.1 GeCKO文库质粒扩增及慢病毒包装 |
| 7.4.2 慢病毒文库感染杂交瘤细胞 |
| 7.4.3 农药压力筛选与流式细胞分选 |
| 7.4.4 NGS扩增子测序数据分析 |
| 7.4.5 差异基因与功能通路富集分析 |
| 7.4.6 shRNA验证Pet2基因和Ccnd2基因功能 |
| 7.5 BJQ杂交瘤细胞转录组与CRISPR library筛选综合分析 |
| 7.5.1 转录组与CRISPR library筛选方法比较 |
| 7.5.2 两种筛选方式共同富集的基因功能及信号通路 |
| 7.5.3 两种筛选方式共同富集的差异基因分析 |
| 7.5.4 杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.6 骨髓瘤细胞SP2/0 与杂交瘤细胞功能基因表达差异分析 |
| 7.7 百菌清农药抗原免疫小鼠脾细胞各阶段转录组分析 |
| 7.7.1 研究对象的选择 |
| 7.7.2 转录组基因表达分析及差异基因筛选 |
| 7.7.3 脾脏转录组显着差异基因GO/KEGG富集分析 |
| 7.7.4 小鼠机体产生抗BJQ特异性抗体的过程 |
| 7.7.5 杂交瘤细胞与机体B细胞抗体合成途径异同 |
| 7.8 抗百菌清特异性单抗合成及分泌途径及调控机制 |
| 7.8.1 杂交瘤细胞的融合与体外培养 |
| 7.8.2 杂交瘤细胞抗体基因编码与表达 |
| 7.8.2.1 DNA编码水平 |
| 7.8.2.2 表观遗传学编码水平 |
| 7.8.2.3 杂交瘤细胞抗体基因表达调控 |
| 7.8.3 杂交瘤细胞周期进程调控 |
| 7.8.4 信号通路与转录因子调控杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.8.5 杂交瘤细胞抗体基因转录后调控 |
| 7.8.6 杂交瘤细胞抗体装配与修饰 |
| 7.8.7 杂交瘤细胞抗体运输及分泌 |
| 7.8.8 杂交瘤细胞调控抗体合成及分泌的相关机制 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 全文总结 |
| 8.2 全文创新点 |
| 8.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要研究成果 |
（4）玉米赤霉烯酮对小鼠B淋巴细胞体外活化的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 上篇 文献综述 |
| 第1章 玉米赤霉烯酮研究进展 |
| 1 玉米赤霉烯酮来源与理化特性 |
| 2 玉米赤霉烯酮的污染状况 |
| 3 玉米赤霉烯酮对动物的毒性 |
| 3.1 ZEA的生殖毒性 |
| 3.2 ZEA的免疫毒性 |
| 3.3 ZEA的内分泌毒性 |
| 3.4 ZEA的遗传毒性 |
| 4 玉米赤霉烯酮对动物毒性的机理 |
| 5 玉米赤霉烯酮的防控 |
| 5.1 ZEA的脱毒措施 |
| 5.2 ZEA中毒的治疗 |
| 第2章 体液免疫应答与B淋巴细胞活化 |
| 1 B淋巴细胞介导的体液免疫概述 |
| 2 B淋巴细胞活化 |
| 2.1 T细胞依赖性抗原 |
| 2.2 T细胞不依赖性抗原 |
| 3 脂多糖对B淋巴细胞的活化作用 |
| 3.1 细胞因子的作用 |
| 3.2 CD分子的作用 |
| 3.3 免疫球蛋白的作用 |
| 4 B淋巴细胞相关信号途径 |
| 5 本研究的目的及意义 |
| 下篇 实验部分 |
| 第3章 ZEA对B淋巴细胞活化增殖的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 溶液及试剂的配制 |
| 2.2 原代B淋巴细胞的分离与培养 |
| 2.3 CCK-8法检测LPS对小鼠未活化B淋巴细胞活化增殖的影响 |
| 2.4 CCK-8法检测ZEA对小鼠B淋巴细胞活化增殖的影响 |
| 2.5 CCK-8法检测ZEA对LPS刺激小鼠B淋巴细胞活化增殖的影响 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 细胞提取结果及纯度鉴定 |
| 3.2 LPS对小鼠B淋巴细胞活化增殖的影响 |
| 3.3 ZEA对小鼠B淋巴细胞活化增殖的影响 |
| 3.4 ZEA对小鼠B淋巴细胞细胞活化增殖的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第4章 ZEA对B淋巴细胞活化分泌功能的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠淋巴细胞分离 |
| 2.2 流式液多重蛋白定量技术检测细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α的分泌 |
| 2.3 流式细胞术检测ZEA对小鼠B淋巴细胞表面抗原的影响 |
| 2.4 ELISA试剂盒法检测ZEA对小鼠B淋巴细胞分泌抗体IgG和IgM的影响 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ZEA对小鼠B淋巴细胞表面抗原CD40表达的影响 |
| 3.2 ZEA对小鼠B淋巴细胞表面抗原CD80表达的影响 |
| 3.3 ZEA对小鼠B淋巴细胞表面抗原CD86表达的影响 |
| 3.4 ZEA对小鼠B淋巴细胞细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α分泌的影响 |
| 3.5 ZEA对小鼠B淋巴细胞抗体IgG分泌的影响 |
| 3.6 ZEA对小鼠B淋巴细胞抗体IgM分泌的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第5章 ZEA对B淋巴细胞活化相关信号通路蛋白的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 免疫磁珠阴性分选B淋巴细胞 |
| 2.2 蛋白样品制备 |
| 2.3 蛋白质免疫印迹(Western Blot) |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ZEA对JNK信号通路蛋白表达的影响 |
| 3.2 ZEA对ERK信号通路蛋白ERK1/2表达的影响 |
| 3.3 ZEA对P38信号通路蛋白表达的影响 |
| 3.4 ZEA对NF-κB信号通路蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（5）弥漫性大B细胞淋巴瘤患者化疗前后免疫功能变化的临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 临床资料 |
| 1.1.1 纳入标准 |
| 1.1.2 化疗方案 |
| 1.1.3 检测方法 |
| 1.2 观察指标 |
| 1.3 疗效标准 |
| 2 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 弥漫性大B细胞淋巴瘤治疗进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（6）脱细胞基质生物材料DNA去除标准和免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 不同DNA/脂质/内毒素残留量ACTM生物材料制备和测定 |
| 一、实验材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 不同DNA/脂质/内毒素残留量ACTM生物材料体外及体内免疫原性实验 |
| 一、体外免疫原性实验 |
| (一)材料与试剂 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| 二、体内免疫原性实验 |
| (一)动物模型的制备 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| 第三部分 不同DNA/脂质/内毒素残留量ACTM材料大鼠部分腹壁肌缺损修复实验 |
| 一、动物模型的创建及修复 |
| (一)材料与分组方法 |
| (二)实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 材料病毒灭活验证方法 |
| 文献综述 脱细胞组织基质(ACTM)生物材料研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（7）脓毒症时OX40-OX40L信号通路失活抑制滤泡辅助T细胞生成并导致B淋巴细胞成熟障碍（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一部分 外周血淋巴细胞计数与脓毒症患者预后关系的研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 研究对象 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.3.1 试验人群 |
| 1.3.2 课题设计 |
| 1.3.3 样本量计算 |
| 1.4 研究方法 |
| 1.4.1 入选标准 |
| 1.4.2 排除标准 |
| 1.4.3 结局指标 |
| 1.4.4 混杂因素 |
| 1.4.5 资料收集 |
| 1.4.6 数据收集时间点 |
| 1.5 试验程序之受试者管理 |
| 1.6 数据安全及监察计划 |
| 1.7 统计分析计划 |
| 1.8 研究结果 |
| 1.8.1 28天内死亡的患者在脓毒症发生时和发生后24小时外周血中淋巴细胞计数较28天内生存者低 |
| 1.8.2 脓毒症发生时和发生后24小时外周血淋巴计数分布情况 |
| 1.8.3 患者基线资料 |
| 1.8.4 外周血淋巴细胞计数小于0.4×109/L的脓毒症患者28天死亡率较高 |
| 1.9 讨论 |
| 1.10 小结 |
| 第二部分 脓毒症患者B淋巴细胞成熟障碍导致免疫抑制和高死亡率 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 研究内容 |
| 2.3.1 试验人群 |
| 2.3.2 课题设计 |
| 2.3.3 样本量计算 |
| 2.4 研究方法 |
| 2.4.1 入选标准 |
| 2.4.2 排除标准 |
| 2.4.3 结局指标 |
| 2.4.4 混杂因素 |
| 2.5 资料收集 |
| 2.6 样本收集时间点 |
| 2.7 实验试剂和方法 |
| 2.7.1 实验试剂 |
| 2.7.2 实验方法 |
| 2.7.3 主要实验仪器 |
| 2.8 试验程序之受试者管理 |
| 2.9 数据安全及监察计划 |
| 2.10 统计分析计划 |
| 2.11 研究结果 |
| 2.11.1 基线资料 |
| 2.11.2 28天内死亡患者外周血中成熟B淋巴细胞较28天内生存患者低 |
| 2.11.3 28天内死亡患者和存活患者外周血中成熟B淋巴细胞死亡无差异 |
| 2.11.4 28天内死亡患者和存活患者促进和抑制骨髓产生B淋巴细胞的细胞因子无差异 |
| 2.11.5 外周血中cTfh细胞与成熟B淋巴细胞计数和免疫球蛋白浓度呈正相关 |
| 2.11.6 流式细胞分析染色方案 |
| 2.12 讨论 |
| 2.13 小结 |
| 2.14 研究局限性 |
| 第三部分 OX40-OX40L信号通路失活抑制滤泡辅助T细胞生成导致B淋巴细胞成熟障碍 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 动物实验 |
| 3.2.2 主要实验试剂及耗材 |
| 3.2.3 主要实验仪器 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.2.5 动物临床状态评分 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 脓毒症时GC反应动态变化 |
| 3.3.2 脓毒症病情重者GC反应明显障碍 |
| 3.3.3 无效治疗限制GC反应 |
| 3.3.4 回输Tfh细胞可改善GC反应和生存率 |
| 3.3.5 OX40-OX40L信号通路失活导致Tfh细胞焦亡 |
| 3.3.6 激活OX40-OX40L信号可改善GC反应 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文结论 |
| 展望 |
| 附表 |
| 附表1 回顾性临床研究伦理批件函 |
| 附表2 回顾性临床研究结题伦理批件函 |
| 附表3 前瞻性观察性临床研究伦理批件函 |
| 附表4 病例报告表 |
| 附表5 受试者招募资料 |
| 附表6 患者知情同意书 |
| 附表7 前瞻性观察性临床研究结题伦理批件函 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文和科研成果目录 |
（8）Setd2在造血干细胞干性维持和淋巴谱系分化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 引言 |
| 1.1 造血干细胞 |
| 1.2 免疫系统 |
| 1.3 淋巴细胞发育 |
| 1.4 RAG蛋白与V(D)J重排 |
| 1.5 DSB非同源末端修复 |
| 1.6 组蛋白的种类以及修饰 |
| 1.7 组蛋白的甲基化及相关的酶 |
| 1.8 先天性免疫缺陷 |
| 第二章 本论文主要解决的科学问题及意义 |
| 第三章 设备耗材与实验材料 |
| 3.1 实验耗材、仪器以及试剂 |
| 3.2 实验方法与流程 |
| 3.2.1 转基因小鼠基因型鉴定 |
| 3.2.2 小鼠骨髓单细胞悬液制备 |
| 3.2.3 小鼠胸腺单细胞悬液制备 |
| 3.2.4 小鼠脾脏单细胞悬液制备 |
| 3.2.5 经眼眶下静脉丛采集小鼠外周血 |
| 3.2.6 流式细胞术及流式染色、检测和分析 |
| 3.2.7 总 RNA分离、总 RNA反转录、Real-time PCR及数据分析 |
| 3.2.8 蛋白免疫印迹检测(Western Blotting) |
| 3.2.9 免疫组织化学染色 |
| 3.2.10 小鼠竞争性骨髓移植实验 |
| 3.2.11 V(D)J重排分析 |
| 3.2.12 染色质免疫共沉淀(Ch IP) |
| 3.2.13 细胞复苏、培养、传代及冻存(以HEK293T细胞为例) |
| 3.2.14 病毒包装与细胞感染 |
| 3.2.15 SETD2 编码区定点突变分析 |
| 3.2.16 质粒抽提 |
| 3.2.17 通过逆转录病毒感染的方法制作TCR过表达的小鼠模型 |
| 第四章 实验结果 |
| 第一节 Setd2在造血系统的表达模式以及 Setd2 转基因小鼠构建策略 |
| 第二节 Setd2 缺失后导致外周淋巴细胞减少 |
| 第三节 敲除Setd2 导致造血干细胞功能受损 |
| 第四节 Setd2 缺失后造成共同淋巴祖细胞的数量积累 |
| 第五节 敲除Setd2 后导致T淋巴细胞发育阻滞在DN3期 |
| 第六节 敲除Setd2 后导致B淋巴细胞发育阻滞在pro-B期 |
| 第七节 Setd2 缺失后导致T淋巴细胞V(D)J重排异常 |
| 第八节 Setd2 缺失后导致B淋巴细胞V(D)J重排异常 |
| 第九节 过表达TCR可以恢复Setd2 缺失导致的T细胞发育阻滞 |
| 第十节 Setd2 缺失后使得Rag1对RSSs位点的识别能力减弱 |
| 第十一节 Setd2 缺失导致V(D)J重排过程中DSB修复异常 |
| 第十二节 Setd2 缺失后没有改变H3K4me3 在淋巴细胞的分布 |
| 第十二节 先天性免疫缺陷病人中有SETD2 突变 |
| 第五章 本论文的总结与讨论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学术论文和科研成果 |
| 附件 |
（9）免疫检查点LAG-3单抗的制备及鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一章 LAG-3额外环的合成及鉴定 |
| 第一节 实验材料及序列 |
| 1.1 LAG-3额外环氨基酸序列 |
| 1.2 合成公司 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.4 合成要求 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.1 多肽的合成 |
| 第三节 实验结果与分析 |
| 3.1 合成报告 |
| 第四节 讨论 |
| 第二章 LAG-3兔单克隆抗体的制备 |
| 第一节 实验材料与试剂 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞系 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 主要溶液的配制 |
| 1.6 主要试剂盒 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.1 实验兔的免疫及免疫效果的鉴定 |
| 2.2 B淋巴细胞的分选 |
| 2.3 LAG-3兔单克隆抗体表达载体的构建 |
| 第三节 实验结果与分析 |
| 3.1 免疫效果的ELISA检测 |
| 3.2 B淋巴细胞的分选 |
| 3.3 有效B淋巴细胞的鉴定 |
| 3.4 抗体表达载体质粒图谱及酶切 |
| 3.5 抗体轻重链可变区的调取及菌液PCR鉴定 |
| 3.6 抗体轻重链可变区序列比对 |
| 3.7 抗体同一克隆株中不同亚克隆轻重链的排列组合 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 LAG-3抗体的表达及鉴定 |
| 第一节 实验材料与试剂 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 主要试剂盒 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.1 LAG-3抗体初步筛选 |
| 2.2 初筛有效抗体的大量表达 |
| 2.3 抗体的纯化 |
| 2.4 抗体纯度的鉴定 |
| 2.5 抗体亲和力及特异性的鉴定 |
| 2.6 LAG-3稳转细胞株的构建 |
| 第三节 实验结果与分析 |
| 3.1 LAG-3有效抗体表达后的初步筛选 |
| 3.2 LAG-3有效抗体可变区序列比对 |
| 3.3 LAG-3有效抗体的表达与纯化 |
| 3.4 LAG-3抗体亲和力的鉴定 |
| 3.5 LAG-3抗体特异性的鉴定 |
| 3.6 LAG-3单抗对人PBMC的识别 |
| 3.7 LAG-3稳转细胞株的鉴定 |
| 第四节 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 索引 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 结论 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PI3Kδ过度活化对脾脏前体B细胞发育的影响研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 结论 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 一例RAC2基因自发突变患儿临床研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
四、只有B淋巴细胞才能表达免疫球蛋白?（论文参考文献）
- [1]IgD-Fc-Ig融合蛋白通过抑制B细胞IgDR-Syk-Btk-NF-κB信号通路对小鼠CIA治疗作用的研究[D]. 张贤政. 安徽医科大学, 2021
- [2]滋阴疏肝法对原发性干燥综合征B淋巴细胞的影响及雷公藤甲素对NOD小鼠唾液腺损伤的研究[D]. 郭云柯. 南京中医药大学, 2020(01)
- [3]杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制[D]. 柳颖. 浙江大学, 2020(01)
- [4]玉米赤霉烯酮对小鼠B淋巴细胞体外活化的影响及机制研究[D]. 李茜. 扬州大学, 2020
- [5]弥漫性大B细胞淋巴瘤患者化疗前后免疫功能变化的临床意义[D]. 刘莎. 右江民族医学院, 2020(03)
- [6]脱细胞基质生物材料DNA去除标准和免疫原性研究[D]. 陈金水. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [7]脓毒症时OX40-OX40L信号通路失活抑制滤泡辅助T细胞生成并导致B淋巴细胞成熟障碍[D]. 段绍霞. 上海交通大学, 2020(01)
- [8]Setd2在造血干细胞干性维持和淋巴谱系分化中的作用及机制研究[D]. 吉忠忠. 上海交通大学, 2020(01)
- [9]免疫检查点LAG-3单抗的制备及鉴定[D]. 方义军. 福建师范大学, 2020(12)
- [10]WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究[D]. 张良. 重庆医科大学, 2020(01)