橡胶树胶乳中膜结合型焦磷酸酶基因的克隆和表达研究

论文摘要

植物组织中有两种类型的焦磷酸酶（pyrophosphatase PPase）,一类是细胞质中可溶性的无机焦磷酸酶（inorganic PPase）,另一类是与细胞液泡膜结合的不可溶性焦磷酸酶（vacuolar PPase,V-PPase）。后者除了水解焦磷酸（PPi）外,还具有质子泵的功能。 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）乳管中V-PPase是调控橡胶生物合成的一个关键酶。它结合于黄色体膜上,除了降解橡胶生物合成过程中产生的PPi之外,还与ATPase协同作用,构成一个完整的质子泵体系,维持黄色体的稳态,调节细胞内的酸碱度,使胶乳中inorganic PPase处于最适的生理环境,及时地催化降解乳管中过多的PPi,从而保证橡胶生物合成能顺利地进行。 为了研究橡胶树胶乳中V-PPase基因表达的分子调控机理,本研究首先利用简并引物,扩增到胶乳中V-PPase基因的一个cDNA片段。然后运用RACE技术,在该cDNA片段的基础上得到了橡胶树胶乳V-PPase基因的全长cDNA序列（已提交GENEBANK,登录号:AY514019）。V-PPase基因可读框（ORF）全长2307bp,编码一分子量约为84.7kDa的769AA的酶蛋白。Northern杂交结果显示,外源茉莉酸（JA）处理橡胶树割面后2天内,胶乳中V-PPase基因的mRNA含量和对照无明显差别,2天后其含量开始逐渐升高,并在第6天达到最大值。外源乙烯（ET）处理橡胶树割面2天后,胶乳中V-PPase基因的转录水平开始升高,第4天达到最大值,并将持续保持至第8天,然后转录水平有所回落,并于第10天下降至原有的对照水平。 本研究还测定了外源JA和ET对胶乳V-PPase酶活性的影响。结果表明,（1）外源JA处理橡胶树割面8小时候后,胶乳中V-PPase的酶活性显著升高,并在第4天达到最大值,此后开始逐步回落,但与对照相比,酶活性仍然保持在较高的水平;（2）外源ET处理橡胶树割面后,胶乳中V-PPase的酶活性有所升高,但升高的趋势和幅度不如外源JA诱导的明显。 应用PET-EP原核表达系统,表达了橡胶树胶乳V-PPase基因可读框（ORF）中的一段cDNA序列,得到了分子量约为32kD的蛋白产物,为制备胶乳V-PPase的抗体和开展V-PPase的组织化学定位等后期研究工作奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 植物焦磷酸酶（PPASE）的研究进展
• 1.1.1 巴西橡胶树中PPASE的研究进展
• 1.1.1.1 巴西橡胶树中PPase的种类及其在橡胶合成中的调控作用
• 1.1.1.2 巴西橡胶树中PPASE的分子生物学研究情况
• 1.1.2 其它植物中PPASE的研究进展
• 1.1.2.1 结构及其生理功能
• 1.1.2.1.1 PPase的结构
• 1.1.2.1.2 PPase的生理功能
• 1.1.2.2 其它植物中PPase的分子生物学研究进展
• 1.1.3 PPASE酶蛋白分离及纯化技术
• 1.1.3.1 无机PPASE酶蛋白分离及纯化
• 1.1.3.2 V-PPASE酶蛋白分离及纯化
• 1.1.3.2.1 膜制剂的制备
• 1.1.3.2.2 从膜制剂中纯化V-PPASE酶蛋白
• 1.2 巴西橡胶树（HEVEABRASILIENSIS）的分子生物学研究进展
• 1.2.1 橡胶延长因子（REF）
• 1.2.2 3-羟基3-甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶
• 1.2.3 含锰的超氧化物歧化酶（MNSOD）
• 1.2.4 法尼磷酸合成酶
• 1.2.5 巴西橡胶树死皮病相关基因
• 1.3 RACE克隆的原理及其优点
• 1.3.1 3′RACE克隆的原理
• 1.3.2 5′RACE克隆的原理
• 1.3.3 与几种常见克隆技术相比，RACE克隆技术的优势
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料及处理
• 2.2 菌种
• 2.3 生化试剂
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 橡胶胶乳总RNA的提取
• 2.4.2 焦磷酸酶（V-PPase）基因部分序列的克隆（EST克隆）
• 2.4.2.1 引物设计
• 2.4.2.2 反转录扩增（RT-PCR）
• 2.4.2.3 PCR产物的凝胶电泳观察
• 2.4.2.4 PCR产物的回收
• 2.4.2.5 PCR目的片段的克隆及重组子筛选
• 2.4.2.6 重组子菌种的保存
• 2.4.3 焦磷酸酶（V-PPase）基因的5′ RACE克隆
• 2.4.3.1 引物设计
• 2.4.3.2 5′ RACE-Ready cDNA的合成
• 2.4.3.3 5′ RACE的PCR扩增
• 2.4.4 焦磷酸酶（V-PPase）的3′RACE克隆
• 2.4.4.1 引物设计
• 2.4.4.2 3′ RACE-Ready cDNA的合成
• 2.4.4.3 3′RACE的PCR扩增
• 2.4.5 NORTHERN杂交
• 2.4.5.1 探针的制备
• 2.4.5.2 橡胶胶乳总RNA的提取
• 2.4.5.3 RNA的印迹转移
• 2.4.5.3.1 电泳系统等实验用具的预处理
• 2.4.5.3.2 RNA的甲醛变性电泳
• 2.4.5.3.3 RNA的印迹转移
• 2.4.5.3.3.1 甲醛变性胶的处理
• 2.4.5.3.3.2 尼龙膜的处理
• 2.4.5.4 杂交
• 2.4.5.4.1 预杂交
• 2.4.5.4.2 探针杂交
• 2.4.5.5 洗膜和检测
• 2.4.6 胶乳中焦磷酸酶（PPASE）活性的测定
• 2.4.6.1 样品的采集
• 2.4.6.2 粗酶液的获得
• 2.4.6.3 底物的配置
• 2.4.6.4 PPase酶活测定的酶促反应
• 2.4.6.5 酶促反应后无机磷释（Pi）放量的测定
• 2.4.6.6 酶活性单位的定义
• 2.4.6.7 C—乳清蛋白质含量的测定
• 2.4.7 焦磷酸酶（V-PPASE）基因的原核表达
• 2.4.7.1 表达引物的设计
• 2.4.7.2 表达片段的PCR扩增
• 2.4.7.3 表达目的片段和载体的制备
• 2.4.7.4 原核表达载体的构建
• 2.4.7.5 诱导表达
• 2.4.7.6 PET-EP原核表达蛋白的提取和SDS—PAGE电泳鉴定
• 3 结果和分析
• 3.1 胶乳总RNA的提取
• 3.2 焦磷酸酶（V-PPASE）基因的EST克隆
• 3.2.1 焦磷酸酶（V-PPase）EST的PCR扩增及阳性重组子的筛选
• 3.2.2 焦磷酸酶（V-PPase）基因的EST克隆测序及序列分析
• 3.3 焦磷酸酶（V-PPase）基因的5′ RACE克隆
• 3.4 焦磷酸酶（V-PPase）基因的3′ RACE克隆
• 3.5 焦磷酸酶（V-PPase）基因全长cDNA克隆的获得
• 3.6 V-PPASE酶蛋白结构预测分析
• 3.7 NORTHERN杂交结果与分析
• 3.7.1 用于Northern杂交印迹转移的胶乳总RNA的电泳检测
• 3.7.2 Northern杂交信号的检测结果
• 3.7.2.1 JA处理的各样品的Northern杂交结果
• 3.7.2.2 ET处理的各样品的Northern杂交结果
• 3.8 胶乳中焦磷酸酶（PPASE）活性的测定结果与分析
• 3.8.1 外源JA和ET处理后，胶乳中V-PPase酶活性的变化
• 3.8.2 外源JA和ET处理后，inorganic PPase酶活性的变化
• 3.9 V-PPASE基因原核表达结果与分析
• 3.9.1 原核表达载体的构建
• 3.9.2 原核表达蛋白的SDS-PAGE电泳
• 3.10 本研究中所用到的部分试剂及其配方
• 4 结论和讨论
• 4.1 结论
• 4.2 讨论
• 3.结束语：
• 附录一 缩略词表
• 附录二 DNA测序图谱
• 附录三 酶活测定数据分析的部分SAS程序
• 参考文献
• 致谢