圆叶牵牛毛状根培养体系的建立及次生代谢产物的研究

论文摘要

圆叶牵牛是旋花科牵牛属草本药用植物,国家药典里收载的一味中药,具有泻水通便、消痰涤饮、杀虫攻积的功效。在我国的分布范围很广,具有很大的开发潜力。本文利用发根农杆菌R1601,1000,1025,15834浸染圆叶牵牛外植体（叶片、叶柄）,对两种外植体的诱导条件进行优化、培养条件进行优化,建立了圆叶牵牛毛状根培养体系,并对由（叶片、叶柄）转化的毛状根和自然根中咖啡酸和多糖进行初测。研究表明,当四种发根农杆菌浸染圆叶牵牛时,叶片和叶柄的最适诱导条件都是：菌株为R1601,预培养时间为60h,侵染时间为6～8min,共培养时间为48h,外源激素NAA的浓度为1ml/L。在无外源激素的情况下,叶片和叶柄的诱导可到达70%和66.67%,当在预培养和共培养的培养基中同时添加1ml/LNAA时,叶片和叶柄的诱导率大大的提高了,可以达到96.67%和93.33%。PCR检测结果表明：所获得的圆叶牵牛（叶片、叶柄）毛状根在423bp处有与rolB基因相同大小条带存在。证明发根农杆菌R1601的Ri质粒中的T-DNA已经成功的整合到圆叶牵牛基因组中。毛状根具有生长迅速、激素自养、生长条件简单、次生代谢产物含量高且稳定以及分化程度高、不易变异等特点,使得毛状根培养成为获得药用次生代谢产物的又一重要途径。因此,通过对圆叶牵牛毛状根培养体系的建立和优化因素的影响,对其毛状根进行了研究。这两种转化的毛状根在不添加外源激素的MS固体培养基上均能自主快速生长,并表现出了典型的毛状根特征,在MS液体培养体系中也都表现出了典型的毛状根特征,其二者的生长周期确定为20d,当添加不同浓度的JA（茉莉酸）时,30μmol/L对二者毛状根的生长最佳。初步分析了圆叶牵牛（叶片、叶柄）毛状根和自然根中的咖啡酸和多糖的含量。通过紫外分光光度法,测定由叶片转化的毛状根中咖啡酸的含量为1.03%,由叶柄转化的毛状根中咖啡酸的含量为1.26%,原植物自然生长的根中咖啡酸的含量为0.93%；由叶片转化的毛状根中多糖含量为2.13%,由叶柄转化的毛状根中多糖含量为2.50%,原植物自然生长的根中多糖含量为1.77%。试验数据得出：原植物自然生长的根中的咖啡酸和多糖含量均无毛状根中的含量高；相对于两种不同外置体诱导出的毛状根,由叶柄转化来的毛状根中的咖啡酸和多糖含量又均高于由叶片转化的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 圆叶牵牛研究概况
• 1.1.1 植物学特征
• 1.1.2 化学成分
• 1.1.3 药理作用
• 1.1.4 临床应用
• 1.2 毛状根培养在药用植物中的理论研究
• 1.2.1 毛状根形成的生物学基础
• 1.2.2 毛状根遗传转化鉴定
• 1.2.3 毛状根诱导原理
• 1.2.4 毛状根诱导方法
• 1.3 毛状根在药用植物中的研究应用
• 1.4 实验思路与内容
• 1.4.1 研究目的与意义
• 1.4.2 研究路线
• 1.4.3 研究内容
• 第二章 圆叶牵牛毛状根培养体系的建立
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 发根农杆菌菌株
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 圆叶牵牛无菌苗的培养
• 2.2.2 发根农杆菌的活化
• 2.2.3 发根农杆菌对圆叶牵的转化
• 2.3 圆叶牵牛毛状根的PCR分子检测
• 2.3.1 仪器与试剂
• 2.3.2 植物基因组DNA的提取
• 2.3.3 发根农杆菌中Ri质粒的提取
• 2.3.4 PCR扩增
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 农杆菌和外植体对圆叶牵牛毛状根诱导率的影响
• 2.4.2 不同侵染时间对圆叶牵牛毛状根诱导率的影响
• 2.4.3 预培养时间对圆叶牵牛毛状根诱导率的影响
• 2.4.4 共培养时间对圆叶牵牛毛状根诱导率的影响
• 2.4.5 外源激素对圆叶牵牛毛状根诱导率的影响
• 2.4.6 有无NAA（1mg/L）对毛状根生长的影响
• 2.5 圆叶牵牛毛状根的PCR分子检测
• 2.6 讨论与小结
• 2.6.1 讨论
• 2.6.2 小结
• 第三章 圆叶牵牛毛状根培养条件的优化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 圆叶牵牛毛状根生长培养基筛选
• 3.2.2 圆叶牵牛毛状根生长周期的测定
• 3.2.3 茉莉酸（JA）对圆叶牵牛毛状根生长的影响
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 毛状根生长培养基的筛选
• 3.3.2 毛状根生长周期的测定
• 3.3.3 茉莉酸（JA）对圆叶牵牛毛状根生长的影响
• 3.4 小结
• 第四章 毛状根次生代谢产物含量初测
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 药材
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 咖啡酸供试品溶液的制备
• 4.2.2 咖啡酸对照品溶液的配制
• 4.2.3 咖啡酸精密度考察
• 4.2.4 咖啡酸重现性考察
• 4.2.5 咖啡酸稳定性考察
• 4.2.6 多糖供试品溶液的制备
• 4.2.7 多糖对照品溶液的配制
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 咖啡酸含量测定结果
• 4.3.2 多糖含量测定结果
• 4.4 小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 后续工作展望
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历