论文摘要
卵巢癌是严重威胁广大妇女生命的常见恶性疾病,其发病率有逐年上升的趋势,死亡率高居女性生殖系统恶性肿瘤之首。本病起病隐匿,早期诊断困难,一经发现多为晚期,目前尚无预防卵巢癌的有效方法。尽管已广泛开展肿瘤细胞减灭术以及术后联合铂类为基础的化疗的方案,但卵巢癌患者的5年存活率仍徘徊在25-30%[1],85%-90%的患者最终仍难免复发和转移,其重要原因是化疗耐药以及化疗毒副反应大,患者难以承受[2; 3]。因此,探讨肿瘤细胞化疗耐药机制和开发新型辅助化疗药物以增强铂类药的化疗效果、减少其毒副作用成为近年来妇科肿瘤学者研究的热点。环氧化酶（COX）是花生四烯酸生物合成前列腺素的限速酶,有COX-1和COX-2两种同工酶。其中COX-2（环氧化酶-2）的过度表达参与了肿瘤的发生和生长[4-8],同时参与多种肿瘤的侵袭和转移[9-11],而且与肿瘤的化疗耐药相关[12; 13]。研究发现COX-2抑制剂能够抑制多种实体肿瘤的生长、侵袭和转移,而且可增加多种化疗药物对肿瘤的细胞毒性[14-18]。已有研究发现在卵巢癌中存在COX-2的稳定表达,而在正常组织中无表达[19; 20]。目前仅有少量关于COX-2抑制剂单独应用于卵巢癌的研究报道,但结果存在争议,机制不明[21-23],塞莱昔布作为COX-2的选择性抑制剂,其与化疗药物联合作用于卵巢癌细胞的研究尚未见报道。研究目的本实验主要研究塞来昔布对卵巢癌细胞SKOV3生长、侵袭和对顺铂药物敏感性的影响,并探讨其可能的分子机制。研究方法第一部分塞来昔布对卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用及作用途径研究本实验通过Proliferation Assay、流式细胞仪细胞周期分析、流式细胞仪细胞凋亡检测等方法研究塞来昔布对卵巢癌细胞SKOV3的增殖、凋亡的影响,同时与siRNA介导的COX-2沉默对SKOV3细胞的上述影响进行比较,探讨COX-2在其中是否起作用,并通过Western blot技术检测相关蛋白（Caspase-9, Caspase-3, PARP, Bcl-2, Bax, Cyclin D1）的变化情况。第二部分塞来昔布对卵巢癌细胞SKOV3对顺铂化疗敏感性的增强作用及作用途径研究本研究通过Proliferation Assay法检测低浓度（10μM,临床可达到的血药浓度）塞莱昔布对卵巢癌SKOV3细胞顺铂敏感性的增强作用,同时以特异性沉默COX-2表达的SKOV3/COX-2i细胞作为COX-2的阴性对照组细胞,探讨COX-2在其中是否起作用,并通过Western blot技术检测相关蛋白（Caspase-9, Caspase-3, PARP, Bcl-2, Bax, P-gp）的变化情况。第三部分塞来昔布对卵巢癌细胞SKOV3侵袭能力的抑制作用及作用途径研究本研究通过细胞基质粘附实验检测各组细胞间的粘附能力,利用transwell小室实验及划痕实验检测各组细胞的侵袭和迁移能力,同时与siRNA介导的COX-2沉默对SKOV3的引起的上述影响进行比较,明胶酶谱法（Zymography）检测MMP-2、MMP-9的活性,Western blot技术检测MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白的变化情况。研究结果1. Proliferation Assay结果显示:24h、48h、72h时,高浓度Celecoxib（50μM）和特异性沉默COX-2表达后可明显抑制卵巢癌细胞SKOV3生长,而低浓度（2μM,10μM）效果不明显;接着流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况,细胞周期结果显示:50μM Celecoxib作用24h和特异性沉默COX-2表达的SKOV3/COX-2i,两组细胞G0/G1期细胞比例增加,S期及G2/M期下降,G1峰之前出现典型的亚二倍体峰;流式细胞仪凋亡检测结果显示:凋亡早期细胞簇群,Annexin V（+）PI（-）和凋亡晚期细胞或死亡细胞簇群,Annexin V（+）PI（+）的细胞明显高于空白对照组和10μM Celecoxib组; Western blot结果显示50μM Celecoxib作用24h和特异性沉默COX-2表达后,SKOV3细胞的细胞周期蛋白Cyclin D1表达量减少,而与凋亡执行密切相关的Caspase-3、Caspas-9和PARP均出现了活化的片段,而Bcl-2家族的Bcl-2和Bax表达无明显变化。10μM Celecoxib作用24h后上述蛋白无相应变化。2.与正常对照组细胞相比,10μM Celecoxib与10μM Cisplatin联合作用SKOV3细胞24h后能明显抑制SKOV3细胞的生长（p<0.05）,而单独用10μM Cisplatin未见明显的生长抑制作用（p>0.05）。两者联合作用于COX-2表达阴性的SKOV3/COX-2细胞后,观察到类似的生长抑制效果。Western blot结果显示联合用药组细胞出现Caspase-9、Caspase-3和PARP的活化片段,Bcl-2、Bax表达无明显变化,而单独用10μM Cisplatin后上述蛋白无明显变化;正常SKOV3细胞几乎不表达多药耐药基因MDR1编码的P-gp蛋白,经10μM Cisplatin作用24h后,P-gp蛋白表达增加,而10μM Celecoxib与10μM Cisplatin联合用药能抑制由Cisplatin引起的P-gp表达增加。3.细胞基质粘附实验结果显示:10μM Celecoxib作用24h后,粘附于Matrigel胶上的SKOV3细胞数明显多于未经Celecoxib处理的SKOV3细胞（p<0.05）;侵袭实验结果显示:经10μM Celecoxib作用24h后,SKOV3细胞穿过人工基底膜的细胞数明显少于未经Celecoxib处理的SKOV3细胞（p<0.05）;划痕实验结果提示:经10μM Celecoxib作用24h后,SKOV3细胞迁移至损伤区的细胞数明显少于未经Celecoxib处理的SKOV3细胞（p<0.05）;转染COX-2 siRNA的SKOV3/COX-2i在上述3个实验中较之正常对照组细胞组无明显差异（p>0.05）。凝胶酶谱实验和Western blot结果显示:经10μM Celecoxib作用24h后,SKOV3细胞MMP-2、MMP-9的活性和表达量受到明显抑制;Western blot结果显示E-cadherin的表达经Celecoxib作用24h后,细胞较之正常对照组和特异性沉默COX-2的SKOV3/COX-2i,E-cadherin表达明显增强。结论1.高浓度的Celecoxib（50μM）可以通过抑制细胞周期蛋白Cyclin D1的表达,活化“Caspase/PARP”通路,实现抑制SKOV3细胞增殖和促进细胞凋亡的作用;通过RNAi技术特异性沉默SKOV3细胞COX-2的表达也可通过上述途径抑制SKOV3细胞的增殖和促进细胞凋亡,但作用要弱于50μM Celecoxib;该作用途径存在COX-2依赖和COX-2非依赖途径,而整个过程是Bcl-2非依赖的。2.小剂量Celecoxib（10μM）与Cisplatin联合用药可抑制SKOV3细胞中由Cisplatin引起的多药耐药基因MDR1编码的P-gp表达增加,活化“Caspase/PARP”通路,增强SKOV3对化疗药Cisplatin的敏感性;通过RNAi技术特异性沉默SKOV3细胞COX-2的表达不能增加SKOV3细胞对Cisplatin的敏感性;小剂量Celecoxib（10μM）对SKOV3细胞对Cisplatin的增敏作用是COX-2非依赖的。3.小剂量Celecoxib（10μM）通过增加E-cadherin的表达,抑制MMP-2、MMP-9的表达和活性,增强SKOV3细胞的粘附力,抑制其侵袭和迁移力;通过RNAi技术特异性沉默SKOV3细胞COX-2的表达不能引起上述变化;小剂量Celecoxib对SKOV3细胞侵袭的抑制作用是COX-2非依赖的。4.Celecoxib具有良好的抗肿瘤作用,其有效浓度10μM是临床作为非甾体抗炎药应用时可达到的,其有望成为新的化疗辅助药,具有很好的临床应用前景。