论文摘要
第一部分SARS-CoV M蛋白的RNA干扰研究SARS冠状病毒（SARS-associated coronavirus,SARS-CoV）属第2组冠状病毒,为球形的单正链RNA包膜病毒,基因组长约30 kb,主要编码六个结构蛋白:刺突糖蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）和新鉴定的ORF3a、ORF7a蛋白,其中M蛋白为病毒外膜的主要组分之一,在病毒组装和出芽中起关键作用。本研究中,我们根据M蛋白在细胞中呈“点状”分布的特点,确定了该蛋白的细胞定位;然后设计针对SARS-CoV M蛋白编码基因的小干扰RNA（small interfering RNAs,siRNAs）,用体外转录法合成siRNAs,筛选出三段能有效、特异地抑制M蛋白表达的siRNA,为研制抗SARS药物提供了一些新靶点。一、SARS-CoV M蛋白在细胞中的定位以EGFP为报告基因,分别将真核表达质粒pEGFP-M和Golgi/pDsRed-N1共转染HEK 293T细胞,转染后48小时,多聚甲醛固定细胞,用共聚焦荧光显微镜观察转染细胞中M-EGFP重组蛋白（绿色荧光）和Golgi-Red重组蛋白（红色荧光）的分布,利用图像重叠软件对二者图像进行叠加。结果显示M-EGFP重组蛋白与高尔基体标记蛋白共定位于细胞质中的高尔基体,而病毒组装发生于内质网—高尔基体中间体,说明M蛋白的定位与其功能密切相关。二、siRNA对SARS-CoV M基因在细胞中表达的抑制采用T7体外转录法合成siRNA,其中三段靶向于M基因,另设阴、阳性对照siRNA。然后将这五段siRNA分别与pEGFP-M共转染HEK 293T细胞。48小时后,荧光显微镜观察M-EGFP重组蛋白的表达;以HEK 293T细胞作空白对照,用流式细胞仪检测各实验组中表达EGFP的细胞数及平均荧光强度,用CellQuest软件进行定量分析;提取细胞总RNA,逆转录后用SARS-CoV M和GAPDH基因特异的引物进行半定量RT-PCR和实时定量PCR（Real-time PCR）分析;Western blot检测M-EGFP重组蛋白的表达。结果显示,与单独转染质粒pEGFP-M组相比,共转染scramblesiRNA组绿色荧光细胞的百分数及平均荧光强度均无明显下降,而共转染EGFP-siRNA组下降了1.9倍和4.3倍,M-siRNA1组下降1.5倍和3.0倍,M-siRNA2组下降1.9倍和3.7倍,M-siRNA3组下降2.2倍和5.0倍;与单独转染质粒pEGFP-M组相比,共转染EGFP-siRNA或M-siRNA组M基因mRNA水平均明显降低,其中共转染M-siRNA1、M-siRNA2及M-siRNA3组下降了约45倍、56倍和52倍,而阴性对照组M基因转录水平无明显抑制,但各实验组内参基因GAPDH的转录水平均未受影响。单独转染pEGFP-M的细胞在转染后48h可检测到明显的M-EGFP蛋白表达,阴性对照组重组蛋白的表达水平与之相似,但共转染EGFP-siRNA、M-siRNA1、M-siRNA2及M-siRNA3组的蛋白表达水平均明显降低,只见很弱的蛋白条带,各组内参GAPDH的表达亦不受影响。这些结果说明siRNAs通过下调靶基因的转录水平,从而有效且特异地抑制靶蛋白的表达。第二部分三个保守的组氨酸残基在SFV感染中的作用SFV（Semliki Forest Virus）属于有包膜的甲病毒,以内吞的方式进入并转运至靶细胞内体,通过内体中的低pH诱导病毒包膜与内体膜发生融合,将病毒基因组释放至胞浆,从而感染细胞。其包膜蛋白E1为Ⅱ类融合蛋白,由富含β二级结构的三个结构域（DⅠ,DⅡ,DⅢ）组成。膜融合过程伴随着融合蛋白一系列的构象变化,如E1/E2的解离、融合肽的暴露和E1同源三聚体（HT）的形成,但膜融合的触发机制目前仍不清楚。前期的研究表明,E2上的一些氨基酸与E1/E2解离有关,而作为融合蛋白的E1,其胞外域在酸性条件下,也能进行膜插入和HT的形成,提示E1本身也具有pH感受系统。那么,是什么控制了E1这种低pH依赖的构象变化?其机制又是什么?由于SFV融合阈值约为pH 6.2,这与组氨酸（Histidine,His）残基的解离常数（pKa～6-7）很接近,推测其质子化状态的改变可能与E1构象的变化有关。因此,本课题应用突变遗传学的方法,将E1中三个保守的His（H3,H125和H331）突变成丙氨酸（Ala）残基,构建含点突变的SFV感染性克隆,研究它们各自在病毒感染和融合中的作用。一、SFV突变体的构建及表型的初步鉴定首先,我们对甲病毒属中不同病毒E1蛋白的序列保守性进行分析,发现SFV E1中有三个His残基（H3,H125和H331）序列高度保守,且在E1晶体结构中处于重要位置,其中H3靠近DⅠ-DⅢ接头区域,H125位于DⅠ/DⅡ铰链区域,H331位于DⅢ和DⅠ相互作用表面,不仅如此,它们在融合前后位置均发生了明显的改变。然后我们应用突变遗传学的方法,将His突变成Ala,构建含点突变的全长SFV克隆,体外转录出全长RNA,电穿孔导入BHK细胞,通过扩散感染实验,分别比较突变体与野生型SFV的感染能力,结果显示,与野生型SFV相比,H125A和H331A突变体的二次感染能力与之相似,而H3A突变体二次感染能力要低很多,但其包膜蛋白E1和E2均能正常表达并转运至细胞表面;对三个突变体的生长动力学检测结果显示,H125A和H331A突变体产生的病毒量和效率与野生型SFV相似,但H3A突变体产生的病毒量始终要低两个数量级左右,但该突变体病毒组装能力正常。因此,H3A突变体感染能力的降低与E1和/或E2蛋白的表达及定位、病毒装配过程无关。二、SFV突变体融合活性的检测我们采用融合—感染实验（FIA）和细胞—细胞融合实验,分别检测病毒与细胞膜的融合活性以及表达并转运至细胞表面的SFV包膜蛋白介导的细胞与细胞的融合活性。FIA实验结果显示,H331A突变体的融合活性与野生型SFV非常相似,但H125A和H3A突变体的融合活性都具有一定的pH迁移,尤其是H3A突变体,需要更低pH刺激才能进行膜融合。H125A和H3A突变体的融合阈值分别为pH5.75和pH5.5（野生型～pH6.25）、融合活性在pH5.5和pH4.5时最高（野生型～5.75）。细胞—细胞融合实验结果与之相似,H331A突变体仍与野生型SFV接近,H125A突变体的融合阈值为pH6,平均融合指数比野生型低20%左右,但合胞体大小和形成效率与野生型无显著差异;而H3A突变体需pH5或更低pH刺激才能发生细胞融合,即使在pH4.5条件下,融合指数仍然比野生型低得多,且合胞体中最多只含4或5个细胞核（野生型多达30个）,约80%的细胞不发生融合,由此可见,H3A突变体的融合活性远远低于野生型SFV,这也是造成该突变体感染能力降低的主要原因,下面我们将检测该突变体融合过程的主要步骤。三、H3A突变体融合过程的检测首先,我们通过在0℃的胰酶消化实验来检测H3A E1/E2异二聚体的稳定性。结果显示,与野生型SFV相似,H3A突变体E1/E2异二聚体在中性pH条件下很稳定,但在酸性条件下二者发生解离。其次,我们采用病毒—脂质体结合实验分析在不同pH条件下,E1/E2解离及随后的E1膜插入活性。仍与野生型SFV相似,酸处理后H3A突变体也能与脂质体发生耦联,共同迁移至蔗糖梯度上层,再次证明H3A E1/E2在酸性条件下发生解离,且单体E1的膜插入能力正常。最后,我们通过SDS敏感实验、胰酶消化实验及E1酸特异的抗体免疫共沉淀实验,来检测H3A突变和野生型SFV形成E1 HT的能力及其特性。结果显示,野生型SFV在低于pH6的条件下均能有效形成正确构象的E1 HT,而H3A突变体只能在更低pH（≤pH5）条件下才能形成HT,且形成效率较低,虽然H3A HT也能在SDS和胰酶消化处理过程中保持稳定,但其酸构象特异的表位不能有效暴露。由此可见,H3A突变并不影响E1/E2异二聚体的解离和单体E1的膜插入,但随后的三聚体构象变化受阻,不能形成正确构象的E1 HT,影响膜融合的发生,从而降低病毒感染效率。四、H3A回复突变体的筛选与鉴定虽然H3A突变体扩散感染效率比野生型SFV低很多,但它能够迅速产生一些回复突变,以弥补这一缺陷。为了能更好地分析和理解H3A突变对低pH依赖的融合活性的调节机制,我们采用琼脂糖法分离单个的回复突变体克隆,然后经扩增培养、病毒RNA抽提、E1基因扩增及测序,共得到十个独立的回复突变体,除了我们引入的H3A突变,均为单点突变;根据它们在E1*HT中的位置,我们将这些回复突变体分成两组:（1）第一组位于DⅠ/DⅢ的柔性接头上,含5个回复突变体,但只包括D284和A286的突变。（2）第二组位于DⅠ中,也含5个回复突变体,包括A3T,P8A,V10A和V140A。这些回复突变所在的位置,都是在E1 HT发夹状构象形成过程中变化最显著的区域。因此,回复突变体的研究将为H3A突变体的表型提供更多结构方面的信息。本课题利用突变遗传学的方法,构建了三个His点突变的SFV感染性克隆,分析并比较了这三个突变体与野生型SFV在病毒感染和膜融合方面的异同,发现H331A突变不影响病毒感染和融合;H125A突变对病毒感染影响不大,融合阈值略有降低;但H3A突变通过影响E1 HT正确构象的形成而降低融合阈值及感染效率。筛选到十个H3A的回复突变体,分析发现它们均位于可能直接参与DⅢ折叠的区域,推测这些回复突变体是通过优化构象来挽救H3A突变体HT的形成,从而提高H3A突变体融合活性和感染能力。这些结果提示H3的质子化与E1 HT正确构象的形成直接相关,对低pH依赖的膜融合具有关键的调节作用。
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