论文摘要
目的：FOXE1（Folkhead box E1）基因是叉头结构域蛋白家族的重要一员,在甲状腺胚胎发育中扮演重要角色。研究发现,FOXE1基因纯合突变可以引起甲状腺发育不全,导致先天性甲状腺功能低下和腭裂等各种畸形。近年的研究发现,FOXE1基因和恶性肿瘤的发生也具有密切联系,甲状腺腺癌和鳞状细胞癌（皮肤、肺、食管等）与FOXE1基因多态性或突变紧密相关,FOXE1基因是这些恶性肿瘤的易感基因。在胰腺癌和乳腺癌中,均有FOXE1基因启动子高甲基化的报道。但在结直肠癌中,尚未见FOXE1基因的相关研究。本研究的目的在于通过检测结直肠癌组织与配对正常肠粘膜中FOXE1启动子区域CpG岛的甲基化情况,结合其在mRNA转录水平及蛋白表达水平的检测,初步揭示FOXE1基因启动子区域CpG岛的甲基化调控其表达及与结直肠癌的发生具有密切相关性。材料与方法：细胞株：肠癌细株:HCT116,RKO,LS147（上海中科院细胞室）组织标本：83例的结直肠癌组织标本均来自2008年12月-2010年3月复旦大学附属肿瘤医院大肠外科手术后标本,均具有配对的距离癌灶至少5cm的癌旁正常粘膜组织。所有标本均为术前未行新辅助放化疗的初治患者,所有手术均为根治性手术切除,并且术后均具有明确的病理诊断。所有肿瘤标本及其对应的正常粘膜组织（距离肿瘤病灶5cm以上）取材时间不超过术后半小时且均保存在-196度液氮中,其中提取RNA的组织均为RNALater保存。所有病人均签署过知情同意书。病理分期严格按照AJCC（美国癌症联合委员会）分期第七版。芯片初筛：大肠外科蔡国响博士前期应用全基因组甲基化芯片（Illumina HumanMethylation27）筛选结直肠癌相关甲基化基因,发现FOXE1等差异甲基化基因,从而为本研究提供候选的目标基因。实验方法：1.采用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测细胞株中基因FOXE1启动子甲基化状态,对其中MSP阳性细胞株采用去甲基化试剂5-aza-2-CdR干预。干预前后分别采用定量甲基化（qMSP）和TaqMan定量PCR（qRT-PCR）检测FOXE1甲基化水平和表达水平。2.在83例结直肠癌组织及其配对癌旁正常粘膜组织中提取DNA并亚硫酸氢盐修饰,采用定量甲基化（qMSP）方法检测基因FOXE1启动子甲基化水平,对有RNAlater保存的40例癌组织及其配对癌旁正常粘膜组织抽提RNA,采用TaqMan定量PCR （qRT-PCR）方法检测FOXE1表达水平。数据分析：根据样本、标准品中目标基因以及内参基因实时定量甲基化PCR扩增的Ct值计算甲基化比例（percentage of methylated reference, PMR）, PMR=100×（目标基因/内参）样本/（目标基因/内参基因）标准品,PMR<4定义为阴性结果（非甲基化）,PMR≥4定义为阳性结果（甲基化）。将每个样本目标基因CT值与内参CT值求delta CT值,将2-ΔCt作为目标基因相对表达量。采用配对卡方检验分析83对癌与癌旁FOXE1基因启动子区域甲基化水平差异,Pearson X2检验分析83例癌组织中FOXE1基因甲基化与临床病理特征的关联性,采用配对t检验分析40对癌与配对正常组织之间FOXE1表达差异,独立样本t检验分析40例癌组织中FOXE1启动子区域甲基化水平与表达之间的关联性。采用Kaplan-Meier检验分析甲基化与预后关系,所有检验均为双侧,P<0.05为有统计学意义.,所有检验均采用SPSS19.0软件包.结果：三株细胞株中FOXE1甲基化水平检测中,RKO为MSP阳性,LS147和HCT116为MSP阴性,去甲基化能上调FOXE1表达。83例癌与配对的正常组织中,FOXE1在83例癌组织中有63例为甲基化阳性,而在配对的正常组织中则均为甲基化阴性。Fisher精确概率法检验显示二者甲基化有明显差异（P<0.001）,在癌组织中中甲基化阳性率显著高于配对正常组织；40对癌与配对的正常组织中,FOXE1在癌组织中表达显著低于癌旁正常组织（P=0.046）；在40例癌组织同时行甲基化和表达的定量检测,独立样本t检验显示癌组织甲基化和表达呈显著负相关（p=0.048）。FOXE1甲基化水平与平均年龄,性别,肿瘤部位,病理类型,分化程度,脉管侵犯情况以及TNM分期等临床病理特征均无明显关联性。生存分析显示,甲基化和非甲基化组患者在DFS（p=0.618）及OS（P=0.500）均没有显著性差异。结论：FOXE1基因启动子高甲基化可能是FOXE1基因表达的调控机制之一,导致FOXE1基因低表达;FOXE1甲基化具有癌特异性,结直肠癌的FOXE1甲基化水平显著高于正常结直肠粘膜。