生物融合蛋白CTB-LK在向日葵中的表达研究

论文摘要

血栓性疾病是一种常见的心脑血管病,严重危害着人类的健康和生命。蚓激酶能溶解血栓,降低血液粘稠度,抑制血小板聚集,降低纤维蛋白原及改善微循环,具有很好的体内外溶栓抗凝作用,在临床上显示对多种心血管疾病具有良好疗效。本研究尝试利用植物生物反应器——向日葵表达生物融合蛋白CTB-LK。首先,将具有良好的免疫佐剂和输送载体功能的CTB的基因ctb与蚓激酶LK的基因lk连接,随后构建植物双元表达载体pX6-ctb-lk,通过电击法将载体质粒导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株C58获得了工程菌。通过农杆菌介导法转化向日葵,经筛选,最终获得了4株具有卡那霉素抗性的向日葵再生植株,其中2株已经获得了向日葵种子。用CTAB法提取向日葵基因组DNA做PCR特异扩增,检测出3株是阳性的,这初步表明ctb-lk基因已经成功导入向日葵的细胞中。提取转基因植株的总RNA做RT-PCR,结果显示向日葵植株扩增出特异性目的片段,证明ctb-lk基因已成功整合到转基因向日葵的基因组中,并实现转录。本研究首次成功地利用向日葵表达了蚓激酶融合蛋白,有关蛋白分离纯化、活性检测及动物学实验等工作还有待进一步展开。该研究为利用植物系统表达外源蛋白提供了一定的技术和理论支持,也为利用转基因向日葵生产其它药用蛋白奠定了坚实的基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 蚓激酶及其研究进展
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 蚓激酶的生理学特征
• 1.1.3 蚓激酶的溶栓机理
• 1.1.4 蚓激酶的临床应用
• 1.1.5 蚓激酶的基因工程表达
• 1.2 植物生物反应器
• 1.2.1 概念和研究现状
• 1.2.2 植物生物反应器的优点
• 1.2.3 当前研究热点
• 1.2.4 向日葵作为植物生物反应器的优势
• 1.3 外源蛋白在植物体内的高效表达策略
• 1.3.1 利用高效表达的启动子和调节序列
• 1.3.2 构建融合基因
• 1.3.3 利用分泌途径将外源蛋白引向特定的部位
• 1.3.4 反义基因技术
• 1.3.5 利用叶绿体基因工程
• 1.3.6 其他策略
• 1.4 霍乱毒素（cholera toxin，CT）及其亚单位
• 1.5 研究目的与意义
• 第二章 植物表达载体的构建
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 酶与试剂盒
• 2.1.3 激素、抗生素与试剂
• 2.1.4 寡核苷酸引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物表达载体的构建
• 2.2.2 工程农杆菌的制备
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 构建的表达载体图谱
• 2.3.2 结果与分析
• 2.3.3 讨论
• 第三章 农杆菌介导的向日葵遗传转化
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 植物材料与农杆菌
• 3.1.2 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 种子的无菌处理
• 3.2.2 外植体的准备
• 3.2.3 农杆菌的培养
• 3.2.4 共培养
• 3.2.5 筛选方案与转基因植株再生
• 3.2.6 组培苗的移栽
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 向日葵的不同生长阶段
• 3.3.2 讨论
• 第四章 转基因向日葵的检测分析
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 酶与试剂盒
• 4.1.3 寡核苷酸引物
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 转基因向日葵的PCR检测
• 4.2.2 转基因向日葵的 RT-PCR 检测
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 转基因向日葵的 PCR 检测
• 4.3.2 转基因向日葵的RT-PCR鉴定
• 4.3.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢