论文摘要
猪圆环病毒2型（PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PWMS）的主要病原,是一种新发现的病毒,它不但可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡,还与仔猪A2型先天性震颤（AII,CT）、怀孕母猪流产、成年猪皮炎肾炎综合征（PDNS）和呼吸道疾病综合征（PRDS）有关。这些疾病的广泛流行严重影响了养猪业的发展,给许多国家和地区带来巨大的损失。更为严重的是PCV2的感染可以造成免疫抑制,引起其他各种病原的继发感染,造成的间接损失难以估计。目前,PCV2已经成为严重阻碍我国养猪业发展的主要病原之一。为了调查确证陕西省是否受到该病的感染,为我国诊断、防制与研究该病提供科学依据和技术手段,笔者进行了陕西省猪圆环病毒2型的研究,取得以下结果:1.陕西省PMWS感染的血清学调查。通过对陕西省多个不同地区的规模化养猪场的PCV2抗体进行检测,结果表明:陕西省该病的平均阳性率为35.9%（171/476）;在不同生长阶段的猪群中,未断奶仔猪阳性率2.3%（2/88）,断奶仔猪阳性率为48.8%（41/84）,肥育猪阳性率为49.4%（39/79）;种公猪阳性率为16.1%（5/31）,后备母猪阳性率为16.9%（20/118）,经产母猪阳性率为57.5%（69/120）。不同地区PCV2感染的程度具有一定的差异,阳性率从20%到65%不等。从血清学方面确证陕西省养猪业已经受到PCV2的感染。2.PCV2 SX株的分离。根据GenBank中猪圆环病毒1型和2型的序列,设计2对套式PCR引物,160头疑死于PMWS的仔猪组织病料提取DNA,进行套式PCR扩增,检测到了87份PCV2阳性病料。取其中3份病料接种PK-15细胞传代培养,提取第10代和20代细胞培养物中的DNA做PCR鉴定,获得了PCV2陕西分离株。从病原学方面证明PCV2已经在陕西省广泛流行。3.PCV2 ORF2基因的克隆及其序列分析。根据GenBank中PCV2 ORF2基因序列设计一对引物,在引物P1中引入KpnI酶切位点,引物P2中引入HindⅢ酶切位点。从PCV2陕西分离株细胞培养物中扩增ORF2基因（702 bp）,并克隆入pMD18-T载体,经PCR、酶切、测序鉴定,筛选出重组质粒pMD-ORF2。对测序结果用DNAStar软件分析并与GenBank上发表的其他序列进行比对,绘制遗传进化树。结果表明,所克隆的ORF2基因与DB分离株核苷酸序列同源性最高为99.7%,与其它PCV2的ORF2核苷酸序列同源性在90.6%～99.7%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.9%～99.6%之间。说明PCV2陕西分离株未发生明显的变异。4.PCV2抗体检测间接ELISA方法的建立。根据GenBank中PCV2 ORF2基因序列设计一对引物,应用PCR扩增PCV2 ORF2基因的3’端约600 bp。该PCV2 ORF2基因已去除终止子,并在其上下游添加Kpn I和Hind III酶切位点。PCR产物用Kpn I和Hind III酶切后与经同样处理过的pBAD/gIIIB Vector连接,转化TOP10细胞后挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序验证后用L-arabinose诱导进行融合表达,表达的蛋白主要以包涵体存在。经过镍离子亲和层析柱纯化,SDS-PAGE显示一条约28 ku的目的条带,纯度达到85%以上。以该28 ku的多肽包被酶标板,建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法。用该方法对陕西关中和陕北多个养猪场的160份血清进行了检测,其结果与用华中农业大学猪圆环病毒2型ELISA检测试剂盒检测的结果一致。5.PCV2 ORF1、ORF2串联基因重组腺病毒的构建及其表达。扩增PCV2的ORF1和ORF2基因,串联克隆入pMD18-T载体后亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,阳性穿梭质粒经Pme I酶线性化后与骨架载体pAdeasy-1在细菌BJ5183内完成重组,获得重组腺病毒质粒。重组腺病毒质粒用Pac I酶线性化后转染293细胞,包装成重组腺病毒,然后从致细胞病变、荧光检测及PCR检测等方面对该重组腺病毒进行了鉴定。以该重组腺病毒免疫小鼠,对免疫鼠血清中PCV2的特异性抗体进行了检测。结果证实成功构建的含有PCV2 ORF1和ORF2基因的重组腺病毒,可诱导机体产生PCV2的特异性抗体,为PCV2活载体基因工程疫苗的研制提供了理论依据。6.猪圆环病毒2型（PCV2） DNA疫苗的研究。根据核定位信号肽MPG的氨基酸序列,并结合PCV2的密码子偏爱性设计引物,PCR扩增出MPG-ORF2基因,并将其克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中构建pAdTrack-CMV-MGP-ORF2质粒。用构建的pAdTrack-CMV-MGP-ORF2做模版,两次PCR扩增获得pcr CMV-MPG-ORF2-SV40end ,将其构建入Pmd18-T载体,即获得了Pmd18-T-CMV-MPG-ORF2-SV40end DNA疫苗。用人工合成的MPG肽和透明质酸酶做佐剂包被构建的3种DNA疫苗后免疫小鼠,并对免疫小鼠做了抗体水平、脾脏淋巴细胞增殖试验、NK细胞杀伤活性、脾细胞中不同淋巴细胞亚群含量变化等方面的检测。结果证实,试验设计的DNA疫苗均能诱导小鼠产生针对PCV2的特异性免疫反应,其中以体液免疫较细胞免疫变化显著。此为首次利用合成核定位肽和透明质酸酶作为DNA疫苗的佐剂进行了PCV2DNA疫苗的探索性研究,为DNA疫苗的研究积累了有用数据。
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摘要ABSTRACT第一章 猪圆环病毒研究进展1.1 猪圆环病毒的发现和命名1.2 猪圆环病毒的病毒学分类地位1.3 猪圆环病毒的全球流行和分布状况1.4 猪圆环病毒的形态学特性1.4.1 游离的PCV 病毒1.4.2 感染细胞内的PCV 病毒1.5 猪圆环病毒的理化特性1.5.1 浮密度及沉降系数1.5.2 理化抗性1.6 猪圆环病毒的基因组1.7 猪圆环病毒的复制与转录1.8 猪圆环病毒编码蛋白的研究1.9 猪圆环病毒2 型引起的疾病及其致病机理1.10 病理学研究1.11 猪圆环病毒感染的诊断1.11.1 病毒分离1.11.2 间接免疫荧光试验（IIF）1.11.3 聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）1.11.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）1.11.5 原位核酸杂交试验（ISH）1.12 猪圆环病毒感染的防制第二章 DNA 疫苗的研究进展2.1 DNA 疫苗的研究进展2.1.1 DNA 疫苗的诞生、发展和作用原理2.1.2 DNA 疫苗的构建2.1.3 DNA 疫苗的免疫方法2.1.4 DNA 疫苗的免疫佐剂2.1.5 DNA 疫苗的优点2.1.6 DNA 疫苗存在的问题2.1.7 DNA 疫苗的影响因素及应用2.2 pAdTrack-CMV 载体2.3 PCV2DNA 疫苗的研究思路第三章 本研究所用表达载体及技术路线简介3.1 大肠杆菌表达外源蛋白研究进展3.1.1 大肠杆菌表达外源蛋白的优缺点3.1.2 大肠杆菌表达外源蛋白的特性及存在形式3.1.3 影响大肠杆菌表达系统表达外源蛋白的因素3.2 腺病毒表达系统3.2.1 腺病毒的基本结构3.2.2 腺病毒的感染机制3.2.3 腺病毒作为载体的发展3.2.4 应用腺病毒表达系统表达外源基因的优点3.2.5 在AdEasy 腺病毒载体系统操作过程需注意一些问克题3.2.6 腺病毒载体的发展前景3.3 论文设计思路及技术路线第四章 陕西7 个地区猪圆环病毒2 型（PCV2）感染的的血清学调查4.1 材料与方法4.1.1 材料4.1.2 方法4.2 结果与分析4.2.1 血清PCV2 抗体检测结果与分析4.2.2 部分血清样品PRV 抗体检测结果及分析4.3 讨论第五章 猪圆环病毒2 型陕西株的分离与鉴定5.1 试剂与材料5.1.1 试剂与细胞系5.1.2 主要仪器5.2 试验方法5.2.1 病料的采集和处理5.2.2 病料的PCR 检测5.3 病毒分离5.3.1 细胞的复苏与培养5.3.2 病毒接种细胞及传代5.3.3 PCR 检测5.4 间接免疫荧光检测5.4.1 滴片的制备5.4.2 染色5.4.3 结果判定标准5.5 结果5.5.1 样品的采集5.5.2 PCR 检测5.5.3 病毒分离5.5.4 PCR 检测5.5.5 间接免疫荧光检测5.6 讨论第六章 猪圆环病毒2 型SX 株ORF2 基因的克隆与序列分析6.1 材料与方法6.1.1 病毒、质粒和菌种6.1.2 试剂6.1.3 引物6.1.4 模板的制备6.1.5 ORF2 基因的扩增及其克隆6.1.6 序列分析6.2 结果6.2.1 ORF2 基因的PCR 扩增6.2.2 重组质粒的筛选结果6.2.3 测序结果及核苷酸序列同源性分析6.2.4 SX 株ORF2 基因编码的氨基酸抗原性和亲水性分析（结果见图6－5 与图6－60）6.3 讨论第七章 猪圆环病毒2 型（PCV2）ORF2 基因的克隆表达与间接 ELISA 检测方法研究7.1 材料7.1.1 宿主菌、质粒及PCV2 参考血清7.1.2 主要仪器7.1.3 主要药品及试剂7.2 方法7.2.1 目的片段的扩增、纯化与回收7.2.2 目的基因的克隆7.2.3 重组质粒的提取与鉴定7.2.4 ORF2 基因原核表达载体的构建7.2.5 重组融合蛋白pBAD/gIII-ORF2 的诱导表达及检测7.3 重组蛋白的纯化与复性及ELISA 方法的建立7.3.1 重组融合蛋白的纯化7.3.2 纯化蛋白的复性7.3.3 ELISA 方法的建立7.4 结果与分析7.4.1 PCR 扩增7.4.2 重组质粒pBAD/gⅢ-ORF2 的酶切和PCR 鉴定7.4.3 ORF2 表达产物的SDS-PAGE 检测和Western blot 分析7.4.4 表达产物的纯化及复性7.4.5 ELISA 方法的建立7.4.6 特异性鉴定7.4.7 临床送检血清的ELISA 检测7.5 讨论第八章 猪圆环病毒2 型 ORF1、ORF2 基因串联重组腺病毒的构建及其免疫效果研究8.1 材料与方法8.1.1 材料8.1.2 方法8.2 重组腺病毒免疫效果研究8.2.1 重组腺病毒的制备及滴度测定8.2.2 动物免疫8.2.3 小鼠血清中PCV2 特异性IgG 抗体的测定8.3 结果与分析8.3.1 PCV2 ORF1、ORF2 基因的PCR 扩增结果8.3.2 pMD18-ORF1-ORF2 质粒的酶切鉴定8.3.3 重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-ORF1-ORF2 的鉴定8.3.4 重组腺病毒质粒pAdTracK-CMV- ORF1-ORF2 的酶切鉴定8.3.5 重组腺病毒的鉴定8.3.6 重组腺病毒免疫小鼠后抗体的检测8.4 讨论第九章 猪圆环病毒2 型（PCV2）DNA 疫苗的研究9.1 材料9.1.1 菌种、质粒、细胞和动物9.1.2 主要试剂9.1.3 主要仪器及器材9.2 方法9.2.1 含PCV2 ORF2 基因的DNA 疫苗的构建9.2.2 DNA 疫苗的制备9.2.3 DNA 疫苗的定量9.2.4 小鼠的免疫9.2.5 DNA 疫苗引发特异性体液免疫反应的抗体效价的检测9.2.6 小鼠脾T 淋巴细胞的制备9.2.7 MTT 法体外检测淋巴细胞增殖9.2.8 自然杀伤细胞活性（NK）检测9.2.9 T 细胞亚群的测定9.3 结果与分析9.3.1 PCR 扩增MPG-ORF2 基因的鉴定9.3.2 pAdTrack-CMV-MPG-ORF2 的酶切及PCR 鉴定9.3.3 pcrCMV-MPG-ORF2-SV40end 扩增的鉴定9.3.4 Pmd18-T-CMV-MPG-ORF2-SV40end 的酶切鉴定9.3.5 目的DNA 疫苗的制备9.3.6 目的 DNA 疫苗稳定性的鉴定9.3.7 DNA 疫苗诱导小鼠产生的特异性抗体反应9.3.8 DNA 疫苗免疫小鼠脾脏淋巴细胞的增殖反应9.3.9 DNA 疫苗免疫小鼠自然杀伤细胞活性（NK）检测9.3.10 DNA 疫苗免疫小鼠脾脏中淋巴细胞亚群含量分析9.4 讨论与结论9.4.1 讨论9.4.2 结论参考文献缩略语及中英文对照致谢作者简介
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