基于多孔材料的蛋白质酶解和富集研究

论文摘要

随着人类基因组计划的逐步完成,科学家们又提出了后基因组计划,以进-步探索基因组学难以回答的问题,蛋白质组（proteome）学研究作为后基因组计划的重要组成亦逐渐成为了21世纪科学发展的前沿。纳米材料由于其尺寸匹配、高孔容、结构和性能可调等特性,已被广泛应用于生物大分子的研究,并发挥了重要的作用。本论文以基质辅助激光解析质谱技术和多孔纳米材料为基础,发展了基于功能多孔材料的蛋白质组学研究的新技术和新方法,有效解决了低丰度蛋白难以鉴定、常规酶解方法效率低等蛋白质组学研究中的问题。本论文的内容主要包括：基于二氧化钛修饰的介孔材料对多磷酸肽的选择性富集鉴定研究、基于大孔氧化硅泡沫材料的蛋白质快速酶解技术以及生物质谱组织成像中的酶解技术研究。论文第一章回顾了生物质谱技术、蛋白质组学、纳米材料等的发展概况,对贯穿全文的基础概念和技术路线进行了详细阐述；同时对生物质谱技术和纳米材料应用于蛋白质组学研究的热点和难点进行了讨论,其中主要关注了蛋白质组研究中的后修饰问题、酶解技术和生物质谱成像等问题,并对这些研究领域的意义、现状、难点和发展前景进行了阐述。第二章中,我们发展了基于二氧化钛修饰的介孔材料对多磷酸化肽段的高效选择性富集、鉴定技术,不同于常用的商业化富集材料,本论文中,‘我们利用TiO2对磷酸化肽的选择性吸附作用和介孔材料特殊空间结构所形成的对多磷酸肽的动力学及热力学吸附效应,并结合具有高灵敏度和精确性的MALDI-TOF-MS技术,成功地实现了对混合溶液中多磷酸化肽的选择性富集和高灵敏度分析鉴定,与其它常用方法相比,分析性能得到明显地提高,可实现低浓度磷酸化肽段的选择性富集和鉴定。论文第三章,在本课题组此前相关研究的基础上,我们以大孔氧化硅泡沫材料MOSF （100nm）为基体,发展出了一种更为高效、便捷的固定化酶纳米限域快速酶解反应技术。通过事先把酶固定于材料上,形成了固定化酶微纳反应器,将该酶反应器直接添加到蛋白质酶解反应体系中,以实现纳米限域的快速酶解反应；由于酶被预先吸附在了材料中,减少了酶分子自身的反应碰撞,更有效避免了酶自降解,同时提升了酶解效率。通过对酶解时间、负载酶量、酶活力稳定性、干扰物对酶解的影响等参数进行优化,并从动力学角度将其与其它介孔材料的固定化酶反应器进行了对比,全面评价和考察了该技术和方法。最后,我们将该固定化酶微纳反应器用于实际样品鉴定,并与常规酶解方法鉴定出来的蛋白进行对比,进一步验证了该方法的高效性和用于实际样品的可行性。论文的第四章,我们将上述快速酶解技术应用于生物质谱组织成像研究,取得了初步的结果。生物质谱组织成像技术是现今蛋白质组学研究中新兴热点,由于组织切片中蛋白成分复杂、种类繁多、稳定性不足,因此如何在维持组织上蛋白信息的完整性、空间信息准确性的同时,对组织中蛋白成分进行有效鉴定,是该项技术要解决的难点和关键,原位酶解技术是其中的关键技术之一。本课题组将此前发展出的快速酶解技术应用于组织切片的原位酶解和鉴定,取得了一定效果。相信随着更多难点的研究和不断破解,我们必将在生物质谱组织成像技术的发展上取得更多进步。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 第一节 相关背景知识
• 1、生物质谱
• 2、蛋白质组学（proteomics）
• 3、利用生物质谱研究蛋白质组学的发展概况
• 4. 多孔纳米材料及其在蛋白质组学研究中的应用
• 第二节 本论文研究的内容及意义
• 参考文献
• 第二章 氧化钛修饰介孔材料对多磷酸化肽的选择性富集研究
• 1. 引言
• 2 实验部分
• 2.1 材料和实验试剂
• 2.2 SBA-15 MCM-41的合成和氧化钛修饰
• 2.3 材料表征
• 2.4 磷酸化蛋白的酶解
• 2.5 功能化介孔材料对磷酸化肽的富集分离
• 2.6 利用IMAC法（金属离子亲和色谱法）进行磷酸化肽的富集分离
• 2.7 MALDI-MS质谱分析和数据库搜索
• 3 结果与讨论
• 3.1 功能化介孔材料的表征
• 3.2 不同材料对多磷酸化肽选择性富集效果的比较
• 2-SBA-15对磷酸多肽的高特异性和高灵敏度富集'>3.3 TiO₂-SBA-15对磷酸多肽的高特异性和高灵敏度富集
• 4 结论
• 参考文献
• 第三章 基于大孔有序氧化硅泡沫材料的酶反应器研究
• 1. 前言
• 2. 实验方法
• 2.1 材料与实验试剂
• 2.2 用于酶固定化的材料的合成
• 2.3 材料的表征
• 2.4 固定化胰蛋白酶反应器的构建
• 2.5 纳米限域的蛋白质酶解
• 2.6 基于MOSF的酶反应器的优化和性能测试
• 2.7 小鼠肝细胞质样本的准备
• 2.8 质谱鉴定和数据库搜索
• 3 结果与讨论
• 3.1 材料的表征
• 3.2 基于MOSF的固定化酶微纳反应器的快速酶解
• 3.3 与基于介孔材料SBA-15的固定化酶反应器的对比
• 3.4 最佳负载酶量的优化
• 3.5 酶与蛋白比例的优化
• 3.6 微纳反应器酶活力稳定性测试
• 3.7 SDS和尿素对该酶反应体系的干扰测试
• 3.8 MOSF固定化酶微纳反应器用于鼠肝蛋白实际样品的快速酶解
• 4 结论
• 5. 附录
• 参考文献
• 第四章 MALDI-TOF生物质谱成像技术研究
• 1、引言
• 2 实验方法
• 2.1 材料和实验试剂
• 2.2 切片的制备
• 2.3 切片的前处理
• 2.4 组织切片的原位酶解
• 2.5 基质的喷涂
• 2.6 质谱鉴定及数据处理
• 3 结果与讨论
• 3.1 切片的制备
• 3.2 前处理方法的选择和优化
• 3.3 不同方法的原位酶解效果对比
• 3.4 基质及其喷涂方式的选择
• 3.5 质谱鉴定结果
• 4 结论
• 参考文献
• 硕士期间发表论文情况
• 致谢