论文摘要
第一部分ConA诱导的小鼠急性自身免疫性肝损害模型的建立和HSC活化水平的变化目的：研究刀豆蛋白A （ConA）注射引起的小鼠急性免疫性肝损伤的病变规律及HSC活化水平的变化,并探讨HSC在小鼠急性自身免疫性肝损害发病机制中的作用。方法：雌性昆明小鼠（7-9周龄）随机分为5组,其中按造模时间点不同分为4组,即2h、8h、24h、48h,另设一组为正常对照组,每组均设小鼠8只。模型组给予ConA （20mg/kg）尾静脉注射制备小鼠急性自身免疫性肝损伤模型,对照组小鼠给予等量生理盐水尾静脉注射。分别于造模后2h、8h、24h、48h麻醉各对应时间点模型组小鼠和对照组小鼠,抽取心脏血液,分离肝脏及脾脏标本。新鲜获取的肝脏及脾脏进行称重,计算肝脾指数。应用全自动生化仪分析检测血清谷丙转氨酶（ALT）,谷草转氨酶（AST）,白蛋白（A）,球蛋白（G）等肝功能指标变化。石蜡切片HE染色观察各个时间点小鼠肝脏病理变化。应用ELISA方法检测小鼠血清TGF-β1及TGF-β3浓度,免疫组化方法检测肝脏组织中HSC活化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及波形蛋白（Vimentin）的表达,应用Western-blot方法检测肝脏组织TGF-β1 TGF-β3、α-SMA及Vimentin蛋白相对表达量。结果：（1）给药后2h模型组转氨酶（ALT, AST）水平均较正常对照组有升高趋势,但未达统计学差异（p>0.05）,给药8h后模型组转氨酶水平达峰值,其中ALT达208.8±107.5U/L,AST达558.5±180.1U/L,与对照组（ALT为38.8±8.9U/L,AST为136±24U/L）相比有显著差异（p<0.01）,给药后24h及48h转氨酶仍较正常对照组增高（p<0.05）,但较8h组为低（p<0.05）。各处理组白蛋白和球蛋白未见明显统计学差异,造模组8h、24h及48h血清白蛋白有降低趋势,而血清球蛋白有增高趋势,但均无统计学差异；（2）肝脾指数变化：注射ConA后,小鼠肝脾指数出现升高趋势,均于8h达到峰值,其中肝指数达6.15±1.53,脾指数达1.93±0.14。2h模型组小鼠肝指数与对照组（4.46±0.32）比较未见明显统计学差异（P>0.05）,而该时间点模型组小鼠脾指数已增高至1.59±0.10,较对照组显著升高（P<0.05）；（3）肝组织学表现：2h组肝组织出现轻度充血,汇管区轻度淋巴细胞浸润,肝细胞形态尚正常,肝索排列稍紊乱。8h组肝脏明显充血,肝窦、肝索基本消失,细胞脂肪变性,汇管区大量炎性细胞浸润。24h组肝组织充血,肝细胞变性,汇管区炎性细胞浸润。48h组小鼠肝细胞轻微变性,汇管区少量炎性细胞浸润。（4）注射ConA后,免疫组化及Western-blot结果显示小鼠HSC活化标志物α-SMA及Vimentin表达较正常对照组明显升高,其中8h组α-SMA及Vimentin蛋白相对表达量分别为1.84±0.33及2.57±0.61,达峰值；（5）注射ConA后各时间点血清TGF-β1表达有升高趋势,其中于8h组为36.43±9.67pg/ml,达峰值,与正常组有显著差异（P<0.01）,肝脏TGF-β1蛋白表达与血清水平基本一致；（6）注射ConA后2h至8h,小鼠血清TGF-β3较正常组明显增高,其中以8h更为显著,P<0.01,24h及48h时间点TGF-β3表达开始下降,且较正常组为低（P<0.05）,肝脏TGF-β3蛋白表达与血清水平一致。结论：（1）尾静脉注射ConA可制备小鼠自身免疫性肝损害模型,观察所见具有时效性,其中在注射后8h小鼠肝损害最为严重,24小时以后肝脏出现自我修复。（2）在ConA诱导的小鼠急性自身免疫性肝损伤过程中,HSC存在早期被激活,并且与肝功能损伤有相关性,TGF-β1及TGF-β3在模型早期的表达失衡可能与自身免疫性肝炎容易发生和进展为肝硬化有关。第二部分GITR信号对ConA诱导的小鼠急性自身免疫性肝损害病变的影响目的：研究GITR/GITRL信号通路在ConA诱发的急性自身免疫性肝损害发病机制中的作用。方法：雌性昆明小鼠（7-9周龄）随机分为正常对照组,ConA模型组及Fc-GITR干预组,模型组设4组时间点,即2h、8h、24h、48h, Fc-GITR干预组设3组时间点,即8h、24h、48h。模型组采用ConA （20mg/kg）尾静脉注射制备小鼠急性自身免疫性肝损害模型；Fc-GITR干预组在相应时间点预先给予腹腔注射Fc-GITR（5μg/只）,1分钟后再给予ConA尾静脉注射（20mg/kg）;对照组小鼠给予等量生理盐水尾静脉注射。注射后于相应时间点,麻醉各组存活小鼠,抽取心脏内血液,分离肝脏标本,并分离脾脏单个核细胞（SPMC）。检测各组血清ALT, AST,白蛋白（A）,球蛋白（G）等肝功能指标。应用Real-time PCR和Western-blot方法检测各时间点模型组和对照组肝脏组织及SPMC中GITR、GITRL表达情况。结果：（1）给药后2h模型组转氨酶（ALT, AST）较正常对照组有升高趋势,但无统计学差异（P>0.05）,给药后8h及24h模型组转氨酶较对照组明显升高,其中8h达峰值（P<0.01）。Fc-GITR干预组转氨酶水平在相应时间点均较模型组低（P值均<0.05）,而与对照组无统计学差异。各相应时间点及各处理组白蛋白和球蛋白未见无明显差异。（2）Fc-GITR干预组小鼠在8h及24h时间点肝、脾指数均较模型组显著降低,同时干预组小鼠死亡率也较模型组显著降低。（3）组织学表现：8h模型组小鼠出现肝脏明显充血肝窦、肝索基本消失,细胞脂肪变性,汇管区大量炎性细胞浸润；24h组小鼠肝脏充血,肝细胞变性,汇管区炎性细胞浸润。Fc-GITR预处理后,各个时间段损伤均明显减轻。对照组小鼠肝小叶结构清晰,肝索排列整齐,中央静脉不充血；（4）8h模型组小鼠肝组织及SPMC中GITR和GITRL基因表达均较正常对照组明显增高,其余时间点未见明显统计学改变。（5）8h模型组小鼠肝组织及SPMC中GITR蛋白相对表达量变化与基因表达一致,而模型组各时间点GITRL蛋白相对表达量无明显统计学改变。结论：上述结果显示,拮抗GITR信号可减轻ConA诱导的小鼠急性自身免疫性肝损伤的病变程度,提示GITR/GITRL可能参与了ConA诱导的小鼠急性自身免疫性肝损害的病变过程,在其发病中可能起一定的作用。第三部分GITR信号对ConA诱导的小鼠急性自身免疫性肝损害模型及体外HSC活化的影响目的：研究GITR/GITRL对ConA诱发的急性自身免疫性肝损害模型及体外HSC活化水平的影响。方法：（1）体内实验：雌性昆明小鼠（7-9周龄）随机分为三组,模型组、Fc-GITR干预组及正常对照组,三组处理方法同前。ConA注射后8h、48h麻醉各组小鼠,行心脏取血,摘取肝脏及脾脏。应用ELISA方法和Western-blot方法检测各组小鼠血清及肝脏TGF-β1及TGF-β3表达水平；应用免疫荧光及Western-blot方法检测各组小鼠HSC活化标志蛋白（Vimentin）的蛋白表达。（2）体外实验：应用Percoll淋巴细胞分离液提取各组小鼠新鲜摘取的脾脏单个核细胞（SPMC）,与原代小鼠HSC共培养,观察各组HSC增殖活化情况；将预先应用Fc-GITR处理的模型组小鼠脾脏单个核细胞与HSC共培养,观察HSC增殖活化情况。结果：（1）给予Fc-GITR干预后,小鼠肝脏HSC活化蛋白Vimentin表达明显较模型组小鼠降低,表明干预GITR信号后,小鼠HSC活化情况减弱；（2）干预组小鼠血清及肝脏TGF-β1较正常对照组及模型组明显减少,TGF-β3的蛋白表达与模型组未见明显统计学差异。（3）体外实验显示,与模型组小鼠脾脏单个核细胞共培养的HSC活化情况较对照组明显升高,而与干预组小鼠脾脏单个核细胞共培养的HSC的活化情况较前者明显减弱,与对照组未见明显差异,给予Fc-GITR预处理模型组小鼠SPMC活化HSC的能力较未给予Fc-GITR预处理的模型组小鼠SPMC明显减弱,与各组小鼠SPMC共培养的HSC增殖情况未见明显变化。结论：体内、体外干预GITR/GITRL信号可明显减弱ConA诱导的小鼠自身免疫性肝损害中HSC活化,表明GITR信号可能参与了ConA诱导的肝损害急性期HSC活化的启动。
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