肾衰养真胶囊对胰岛素诱导的脂肪细胞瘦素及C/EBPα表达的影响

论文摘要

【背景】营养不良是慢性肾衰竭（chronic renal failure,CRF）患者（包括透析和非透析）临床常见的重要并发症。国内报道65%以上终末肾脏病人发生营养不良。营养不良可加重免疫功能低下、贫血等,甚至导致多脏器衰竭,其发生不仅影响CRF患者的预后,而且与其死亡率密切相关。CRF营养不良研究成为近年来国际国内肾脏病领域研究的重点课题。瘦素（Leptin）是新近发现由肥胖基因（Obesegene,Ob gene）编码的激素样蛋白,其分子量为16KD,主要功能是降低食欲,增加能量消耗,导致体重减轻。研究表明,Leptin与CRF关系密切,许多CRF患者,包括腹透、血透、肾移植的终末期肾衰患者均合并高Leptin血症。CRF时肾小球滤过率下降,肾脏清除能力下降是Leptin升高的主要原因。另外CRF患者代谢紊乱如高胰岛血症、炎症、高胆固醇血症等均可上调Leptin基因的表达,导致体内Leptin升高。研究发现,CRF透析患者血Leptin与体脂含量之比与患者蛋白质摄入量呈显著负相关,与血清白蛋白、转铁蛋白呈负相关,与蛋白分解率呈负相关,提示Leptin与营养不良关系密切。目前国内许多学者亦发现Leptin与CRF营养不良关系密切,是导致CRF患者厌食和营养不良的重要因素,但缺乏深入的细胞分子机制研究。Leptin由脂肪细胞合成后以内分泌、自分泌或旁分泌的形式作用于分布在多个部位的OB-R,从而发挥一系列效应。包括:抑制食欲、减少能量摄取;增加交感神经系统的活性,使大量贮存的能量转变成热能释放,产热增加;加重胰岛素抵抗,对胰岛素的合成、分泌发挥负反馈调节等。CRF患者体内存在的高瘦素血症可引起患者食欲抑制,能量消耗增加,体重减轻,导致CRF患者营养不良。由于CRF营养不良病因病机十分复杂,CRF营养不良临床治疗显得十分棘手,不可能找到特异性的药物。西医方面,一是替代疗法,如静滴氨基酸、白蛋白、能量合剂、水溶性维生素,注射重组生长激素及IGF-1,氨基酸透析等处理,以上疗效短暂有限且价格昂贵。二是口服药物开同（主要成分为复方α—酮酸片）,开同是一种必需氨基酸和酮酸的混合制剂,其本身不含氮,在蛋白合成过程中利用尿素,其疗效亦有限且价格较贵。以上均不适合我国国情,难以得到普遍应用,寻求一种经济有效的治疗方法迫在眉睫。中医药能有效改善营养不良,且在药效上各有侧重,作用机理和途径也有所不同,因此,积极寻求改善CRF营养不良的中药具有重要意义。【目的】观察肾衰养真胶囊含药血清对胰岛素诱导的脂肪细胞瘦素及C/EBPα表达的影响,探讨肾衰养真胶囊改善CRF营养不良的机制。【方法】1.药物血清制备:通过给予大鼠分别灌服中药肾衰养真胶囊、开同和生理盐水制备肾衰养真胶囊含药血清、阳性对照开同含药血清和空白血清。2.脂肪细胞培养分组:原代培养大鼠前脂肪细胞,诱导分化为成熟脂肪细胞,通过油红O染色鉴定为脂肪细胞。脂肪细胞随机分为5组:正常细胞组、胰岛素刺激组、空白血清组、中药血清组和开同血清组,每组6孔,以相应的试剂及药物血清干预48小时后,吸取上清,并提取细胞总RNA。3.放免法检测细胞上清Leptin分泌水平。4.RT-PCR法检测脂肪细胞OB mRNA和C/EBPαmRNA表达:Trizol法提取和纯化脂肪细胞总RNA,以0.1%DEPC处理水50μl溶解后分装,加RNAin保存于-80℃冰箱。设计OB、C/EBPα及内参GAPDH引物序列,取总RNA5μl进行逆转录,42℃,60分钟形成cDNA,94℃,5分钟,灭活逆转录酶,然后进行PCR扩增。取扩增产物5μl,加上样缓冲液1μl,在1.5%琼脂糖凝胶中电泳,缓冲液为0.5×TBE电泳缓冲液,恒定电压90 v,80分钟。于紫外灯下拍照,将胶片上反应带在凝胶成像分析系统中扫描、分析电泳带的灰度。目的基因mRNA表达量=每例标本目的基因凝胶图像平均灰度值/同一标本GAPDH凝胶图像平均灰度值。【结果】1.前脂肪细胞经激素、IBMX、胰岛素诱导后可分化为成熟脂肪细胞,镜下观察细胞形态上由纤维状梭形变成椭圆形圆形,胞质中出现脂肪滴,随着分化程度的加深,脂肪滴逐渐变大,油红O染色见胞浆内脂滴呈橘红色。2.各组细胞瘦素分泌水平的变化:脂肪细胞经胰岛素处理48h后,胰岛素刺激组细胞Leptin分泌量较正常细胞组显著增高（P=0.001）。经药物血清干预后,中药血清组细胞Leptin分泌量较胰岛素刺激组显著降低（P=0.027）,开同血清组与胰岛素刺激组比较无统计学差异（P=0.512）,中药血清组细胞Leptin分泌量较开同血清组降低,但无统计学意义（P=0.104）。3.各组细胞OB mRNA的表达:各组间OB mRNA相对表达量比较具有显著性差异（F=10.323,P＜0.001）。胰岛素刺激组细胞OB mRNA相对表达量较正常细胞组显著增高（P＜0.001）,中药血清组与胰岛素刺激组相比较,脂肪细胞中OB mRNA表达水平显著下调（p=0.005）;开同血清组OB mRNA表达水平较胰岛素刺激组降低,但无统计学差异（P=0.433）;中药血清组与开同血清组比较OB mRNA表达显著下调（p=0.033）。4.各组细胞C/EBPαmRNA的表达:各组间C/EBPαmRNA相对表达量比较具有显著性差异（F=5.421,P=0.003）。胰岛素刺激组细胞C/EBPαmRNA相对表达量较正常细胞组显著增高（P=0.001）,中药血清组与胰岛素刺激组相比较,脂肪细胞中C/EBPαmRNA表达水平显著下调（p=0.002）;开同血清组C/EBPα表达水平较胰岛素刺激组降低,但无统计学差异（P=0.260）。【结论】肾衰养真胶囊药物血清可直接作用于脂肪细胞,通过抑制胰岛素刺激引起的脂肪细胞OB mRNA和C/EBPαmRNA的高表达,抑制Leptin的过度分泌。这可能是肾衰养真胶囊改善CRF营养不良的重要机制之一,从而为其临床应用及新药开发提供了实验依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1、Leptin来源、主要生理功能
• 2、CRF患者体内leptin水平变化及其发生机制：
• 3、中医药与CRF患者营养不良的关系
• 4、本课题研究的主要内容
• 第一章:肾衰养真胶囊对胰岛素刺激的大鼠脂肪细胞Leptin表达的影响
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第二章:肾衰养真胶囊对胰岛素刺激的大鼠脂肪细胞C/EBP α表达的影响
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 综述
• 附录
• 中英文对照缩略词表
• 攻读硕士学位期间成果
• 致谢
• 统计学审稿证明