人源羊水干细胞分离培养、生物学特性检测及诱导分化研究

论文摘要

由于胚胎干细胞的研究受到伦理道德问题的束缚与限制,很多研究者开始尝试寻找新的干细胞来源。2003年,Prusa等在羊水中发现Oct-4阳性细胞,提示羊水中可能存在多能干细胞。2007年,Paolo等报道,他们在人的孕中期羊水中发现少量具有ES细胞特性的干细胞,将其命名为人羊水源干细胞（human Amniotic Fluid Stem Cell,hAFS cell）。这种细胞表达ES细胞和成体干细胞标志基因,体外诱导可分化为包括三个胚层的细胞,且通过了功能测试。hAFS细胞的特点是容易获取,不会损害母体及胚胎,可为细胞和组织工程治疗提供新的种子细胞来源。本实验自人孕中期、孕晚期羊水中分离培养hAFS细胞,检测了羊水标本性状对细胞原代培养的影响,筛选并优化了细胞培养体系。同时,通过RT-PCR、免疫细胞化学和流式细胞仪技术分选等技术,对hAFS细胞的生物学特性进行了检测,并诱导hAFS细胞向心肌细胞和神经细胞分化。（1）羊水标本性状对hAFS细胞原代培养的影响从医院妇产科收集孕中期及孕晚期羊水标本,离心收集细胞,加入羊水干细胞培养液（ACM）进行培养,记录原代细胞贴壁时间及贴壁细胞数量,探讨人羊水标本性状等因素对原代分离培养的影响。实验结果表明,孕中期（4.7±0.6 d）与孕晚期（6±0.5 d）羊水标本中细胞的贴壁时间有明显差异（P<0.05）,孕晚期贴壁时间较长。羊水中血细胞污染程度对贴壁时间有明显影响,重度污染组（10.8±0.3 d）与无污染组（6±0.5 d）、轻度污染组（6.3±0.6 d）贴壁时间差异显著（P<0.05）。羊水体积对细胞贴壁时间没有明显影响,但对贴壁细胞数量有显著影响（P<0.05）。整个实验系统地检测了羊水干细胞原代培养的影响因素,为羊水干细胞研究提供了可以借鉴的资料。（2）hAFS细胞分离培养及生物学特性检测培养人孕中期及孕晚期羊水标本,通过机械方法分离纯化hAFS细胞,采用RT-PCR、免疫细胞化学和流式细胞仪分选等技术对其生物学特性和分化潜能进行了检测。结果表明,在原代细胞培养的基础上,通过机械分离方法,可得到成纤维样hAFS细胞。这种细胞表达胚胎干细胞的特异性基因标志Oct-4、hTERT、Nanog、SSEA-1、SSEA-4和CD117,不表达SSEA-3;表达间充质干细胞的特异性基因标志CD29、CD44、CD73、CD90和CD105;不表达造血干细胞和造血细胞的特异性基因标志CD34、CD133和CD45;另外,这种细胞还表达HLA-ABC,弱表达HLA-DR。将hAFS细胞在体外多次传代后（已传至45代）,仍具有较强的增殖能力,细胞核型正常。hAFS细胞在悬浮培养条件下可聚集形成类胚体,碱性磷酸酶（AP）检测呈阳性,表达三胚层特异性基因标志,如,外胚层:fgf5;中胚层:ζ-globin;内胚层:α-fetoprotein,证明其具有向三个胚层分化的潜能。同时,本实验筛选含不同浓度FBS及KSR的ACM培养液,表明hAFS细胞可在含KSR的无血清培养体系中扩增。（3）hAFS细胞向心肌细胞诱导分化采用人孕晚期羊水中分离得到hAFS细胞,通过形成类胚体（EB）诱导和单层诱导两种方法,结合不同的诱导液,诱导hAFS细胞向心肌细胞分化,比较诱导效果,筛选最适的诱导体系。结果表明,在不同诱导条件下,均得到α-actin染色阳性细胞,表达心肌细胞特异标志基因Tbx5、Nkx2.5、GATA4和α-MHC。比较不同诱导液对细胞诱导效果的影响发现,条件诱导液组的诱导效果显著优于RA和DMSO组（P<0.05）。在相同诱导液诱导条件下,通过形成类胚体诱导hAFS细胞向心肌细胞分化的效果显著优于单层诱导组（DMSO和条件培养液诱导,P<0.05）。以上结果表明,诱导hAFS细胞向心肌细胞分化时,通过形成类胚体并采用条件培养液的诱导效果最好。（4）hAFS细胞向神经细胞诱导分化由人孕晚期羊水中分离得到hAFS细胞,采用形成类胚体（EB）诱导和单层诱导两种方法,结合不同的诱导液,诱导hAFS细胞向神经细胞分化,通过比较诱导效果,筛选最适的诱导体系。结果表明,在不同诱导条件下,均得到Nestin、NSE阳性细胞,分化的细胞体积变小,胞质收缩,细胞逐渐呈锥形或三角形,表达神经细胞特异性基因标志fgf-5和CD56。在采用RA进行诱导时,单层诱导组诱导结果与类胚体诱导组类似,但相应阶段Nestin、NSE的相对表达量及阳性细胞百分比高于类胚体诱导组,且差异显著（P<0.05）。比较不同浓度β-Me的单层诱导效果,表明5mmol/Lβ-Me组诱导效果较好,且诱导时间应控制在34h之内,但在β-Me诱导条件下,未检测到NSE阳性细胞。以上结果表明,诱导hAFS细胞向神经细胞分化时,采用RA诱导液并进行单层诱导的效果较好。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 羊水和羊水细胞
• 1.1 羊水细胞概述
• 1.2 羊水中细胞的来源及种类
• 1.2.1 上皮样细胞
• 1.2.2 羊水特异细胞
• 1.2.3 成纤维样细胞
• 1.3 羊水中的多能干细胞
• 1.3.1 羊水干细胞
• 1.3.2 羊膜细胞
• 1.4 羊水中细胞的研究前景
• 1.5 结语
• 第二章 羊水干细胞
• 2.1 AFS 细胞的来源
• 2.2 AFS 细胞的分离培养
• 2.2.1 免疫磁珠分选法
• 2.2.2 差异贴壁与机械分离法
• 2.2.3 流式细胞仪分选法
• 2.3 AFS 细胞的生物学特性
• 2.3.1 AFS 细胞形态及增殖能力
• 2.3.2 表型特征
• 2.3.3 致瘤性
• 2.4 AFS 细胞的分化潜能
• 2.4.1 脂肪细胞
• 2.4.2 成骨及软骨细胞
• 2.4.3 肌细胞和心肌细胞
• 2.4.4 内皮细胞
• 2.4.5 神经细胞
• 2.4.6 肝细胞
• 2.4.7 肾脏细胞
• 2.5 AFS 细胞应用前景
• 2.5.1 胎儿组织工程
• 2.5.2 细胞治疗
• 2.5.3 药物筛选和体外发育模型的建立
• 2.6 结语
• 第三章 羊水干细胞与胚胎干细胞、间充质干细胞
• 3.1 胚胎干细胞（EMBRYONIC STEM CELL，ES CELL）
• 3.1.1 胚胎干细胞的来源
• 3.1.2 ES 细胞生长特性及增殖能力
• 3.1.3 表型特征
• 3.1.4 分化潜能
• 3.2 间充质干细胞（MESENCHYMAL STEM CELL，MSC）
• 3.2.1 MSC 的来源
• 3.2.2 生长特性及增殖能力
• 3.2.3 表型特征
• 3.2.4 分化潜能
• 3.3 AFS 细胞与ES 细胞、MSC 比较
• 3.4 结语
• 试验研究
• 第四章 羊水标本性状对HAFS 细胞原代分离培养的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 怀孕时间的影响
• 4.2.2 羊水中血细胞污染程度的影响
• 4.2.3 羊水体积及细胞含量的影响
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 HAFS 细胞分离培养及生物学特性检测
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 hAFS 细胞的形态观察
• 5.2.2 培养体系的筛选
• 5.2.3 生长曲线及群体倍增时间
• 5.2.4 hAFS 细胞特异标志基因的表达
• 5.2.5 hAFS 细胞细胞周期与倍型分析
• 5.2.6 hAFS 细胞可形成类胚体
• 5.3 讨论
• 5.3.1 hAFS 细胞分离培养
• 5.3.2 培养体系筛选
• 5.3.3 hAFS 细胞多次传代后仍具有正常的二倍体核型
• 5.3.4 hAFS 细胞具有多向分化潜能
• 5.4 小结
• 第六章 HAFS 细胞向心肌细胞诱导分化
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果
• 6.2.1 hAFS 细胞向心肌细胞诱导分化
• 6.2.2 通过形成类胚体诱导的结果
• 6.2.3 单层诱导的结果
• 6.2.4 通过形成类胚体诱导和单层诱导的诱导效果比较
• 6.2.5 心肌细胞特异标志基因的表达
• 6.3 讨论
• 6.3.1 hAFS 细胞分化为心肌细胞的可能性
• 6.3.2 AFS 细胞应用于心肌疾病临床治疗的优势
• 6.3.3 AFS 细胞应用于心肌疾病临床治疗时存在的问题
• 6.4 小结
• 第七章 HAFS 细胞向神经细胞诱导分化
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 方法
• 7.2 结果
• 7.2.1 hAFS 细胞向神经细胞诱导分化
• 7.2.2 RA 诱导液诱导的结果
• 7.2.3 不同浓度β-Me 诱导的结果
• 7.2.4 神经细胞特异标志基因的表达
• 7.3 讨论
• 7.4 小结
• 结论
• 论文创新点及进一步研究的课题
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介