天然药物芹菜素拮抗Hsp90介导肿瘤杀伤的机制研究

论文摘要

芹菜素（Apigenin）是一种广泛存在于多种水果蔬菜中的黄酮类化合物。体外和动物实验结果表明,芹菜素对乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和白血病等多种肿瘤都具有拮抗作用,但对正常细胞却几乎没有影响。在关于其抗肿瘤作用机制的研究中,主要发现是能够增强活性氧水平、诱导促凋亡蛋白表达、改变细胞周期蛋白表达、阻断生存信号通路。芹菜素能够对细胞产生广泛的生物学效应,如抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡等,但其具体的作用机制尚不是完全清楚。热休克蛋白90（Heat shock protein, Hsp90）是细胞内最重要、含量最丰富的分子伴侣蛋白,在维持其底物蛋白的稳定构象与正常功能中起着重要作用。Hsp90的底物蛋白多是细胞内信号转导通路的关键蛋白成分,与肿瘤的发生、发展密切相关。Hsp90与其底物蛋白的相互作用需要一些辅助伴侣分子（co-chaperones）的参与,如Hsp70、Hop、Cdc37、p23等。其中,Cdc37能够特异性地募集多种蛋白激酶（如Raf-1、Akt、Src和Cdk4等）与Hsp90结合形成分子伴侣复合体来共同地维持底物蛋白的稳定性和激酶活性。然而Cdc37蛋白只有在CK2激酶的作用下发生Ser13位点的磷酸化修饰,才能变成活性形式参与形成分子伴侣复合体,提示抑制CK2的激酶活性有可能通过调节Cdc37的磷酸化来影响细胞内多项生命活动。芹菜素能够竞争性地结合到CK2的ATP结合位点上,抑制其激酶活性。为探讨芹菜素是否能够通过抑制Cdc37的磷酸化来抑制Hsp90的分子伴侣功能,促进其多种底物蛋白降解,进而对细胞形成“多靶点打击”的效果,我们首先以前列腺癌细胞为模型,探讨了芹菜素对细胞内Hsp90蛋白的影响及其作用机制。在前列腺癌细胞内,芹菜素能够抑制细胞的增殖、阻断细胞周期、并诱导细胞凋亡。在雄激素依赖性的LNCaP细胞内,芹菜素能够剂量和时间依赖性地促进雄激素受体（AR）经蛋白酶体通路降解,并抑制其转录激活活性。Western blot实验进一步证实芹菜素也能够促进Hsp90的其他底物蛋白经泛素蛋白酶体通路降解,而且这种作用与细胞凋亡无关。这说明芹菜素对Hsp90的分子伴侣功能具有抑制作用。ATP pull-down、免疫沉淀以及蛋白印迹实验结果证实,芹菜素既不能象GA那样直接与Hsp90结合、抑制蛋白与ATP结合的能力;也不能象FK228那样通过增强Hsp90的乙酰化来抑制Hsp90的分子伴侣功能。这说明芹菜素可能是通过间接的方式来抑制Hsp90的分子伴侣功能。后续的实验结果显示,芹菜素能够下调前列腺癌细胞内CK2蛋白水平、并抑制其激酶活性。伴随着CK2激酶活性的阻断,Cdc37的磷酸化也随之降低,同时Cdc37与Hsp90及其底物蛋白（如AR和Cdk4）的结合也逐步减少,说明分子伴侣复合体结构被打破,底物蛋白与之解离并经蛋白酶体通路降解。采用RNA干扰的方法特异性地抑制Cdc37的表达后,多种Hsp90的底物蛋白也相应发生下调。该结果进一步证实Cdc37在维持Hsp90底物蛋白的稳定性中起着重要的作用。我们的实验还证实,芹菜素和Hsp90的抑制剂GA或Hsp70的抑制剂Quercetin联用时,对底物蛋白的清除作用更为彻底,提示同时阻断分子伴侣复合体的不同成分,可以协同地抑制其分子伴侣功能。由于在多发性骨髓瘤细胞系及原代骨髓瘤细胞内CK2也呈高表达状态,并且细胞的生存依赖于其高激酶活性。我们又继续探讨了芹菜素对骨髓瘤细胞的影响。结果表明,芹菜素不仅能够抑制多种多发性骨髓瘤细胞系的增殖,还可以抑制细胞内的CK2激酶活性,促进多种Hsp90底物蛋白经蛋白酶体通路降解。实验还证实,芹菜素对细胞的杀伤效果与细胞内CK2蛋白的抑制程度有关。芹菜素能够抑制细胞内组成性和外源性细胞因子（如IL-6、IGF-1等）激活的生存信号通路;并活化死亡受体介导的Caspase-8/Caspase-3凋亡信号通路,最终诱导细胞发生细胞凋亡。对分离的原代骨髓瘤细胞研究发现,芹菜素能够选择性地抑制原代肿瘤细胞的增殖,但对正常的外周血单个核细胞（PBMC）没有影响。芹菜素也可以下调原代骨髓瘤细胞内的CK2蛋白水平,促进多种Hsp90底物蛋白降解,并激活Caspase-8/Caspase-3信号通路,诱导细胞凋亡。综上所述,我们证实了芹菜素新的抗肿瘤作用机制:通过抑制Cdc37的磷酸化间接地抑制Hsp90的分子伴侣功能,导致分子伴侣复合体结构破坏,促进其底物蛋白经蛋白酶体通路降解,从而对细胞产生“多靶点打击”的效应。实验结果还证实“Hsp90/Cdc37分子伴侣复合体”为筛选新型的Hsp90功能抑制剂提供了新的作用靶点。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 芹菜素对前列腺癌细胞的影响
• 1、材料和方法
• 2、实验结果
• 3、讨论
• 第二部分 芹菜素影响 Hsp90 功能的作用机制研究
• 1、材料和方法
• 2、实验结果
• 3、讨论
• 第三部分 芹菜素对多发性骨髓瘤的影响及其作用机制探讨
• 1、材料和方法
• 2、实验结果
• 3、讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 在学期间发表的相关论文
• 个人简历
• 致谢
• 附录 实验使用溶液配方