甲型H1N1流感病毒HA重组蛋白的表达及鉴定

论文摘要

流感病毒属于正黏病毒科流感病毒属,是单股负链RNA病毒,基因组由8个RNA片段组成,共编码至少11种蛋白,依据NP蛋白的不同,流感病毒分为甲型、乙型与丙型流感病毒,即A型、B型、C型。根据HA与NA的不同可以将甲型流感病毒划分为16个HA亚型,9个NA亚型。血凝素（Hemagglutinin, HA）是最重要的表面抗原之一,HA的主要功能是与宿主细胞上的唾液酸受体结合,使病毒粘附于细胞,辅助病毒穿膜内吞。人和禽源的流感病毒HA识别的唾液酸受体不同,这也是决定病毒跨种间传播的机制之一。HA还是流感病毒主要的毒力因子之一,是病毒的中和抗原。2009年四月墨西哥、美国等世界各地相继爆发甲型H1N1流感,它是猪、禽、人流感病毒发生重配后的新毒株。自1918年西班牙大流感爆发以来,H1N1亚型毒株引起的流感已有近百年的历史,因此甲型H1N1流感病毒的研究具有重要的公共卫生意义。首先我们利用大肠杆菌原核表达系统,通过大肠杆菌表达并纯化获得大量的甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白。方法：我们人工合成A/California/04/2009 H1N1流感病毒HA基因,以其为模板,PCR扩增HA的一部分基因,去除HA蛋白信号肽、跨膜区、胞内区的基因序列,仅扩增HA1和HA2的基因。将扩增的基因构建到pET 28（a）质粒上,重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）, IPTG诱导表达HA蛋白,并经过Ni-NTA His Bind柱对其进行纯化,SDS-PAGE电泳鉴定HA蛋白的表达,western blot鉴定HA蛋白的免疫反应原性。试验结果表明,我们通过大肠杆菌表达获得了HA的截短表达蛋白,并制备了较高纯度的蛋白,此外western blot显示HA蛋白具有很好的免疫反应原性,为建立甲型H1N1流感病毒检测技术奠定了基础。为了获得具有生物活性的甲型H1N1流感病毒HA蛋白,我们利用Bac-to-Bac Baculovirus Expression System表达截短HA蛋白,western blot及IFA方法鉴定其表达情况。方法：采用PCR方法扩增A/California/04/2009（H1N1）HA基因,将其克隆到pFastBacHT A载体上,重组质粒pFastBacHT-HA经双酶切及测序鉴定正确后,转化阳性重组载体进入E.coliDH10Bac感受态细胞中,通过Bluo-gal蓝白斑筛选、PCR鉴定获得重组转座子rBacmid-HA。从重组转座子中提取rBacmid-HA质粒DNA转染sf9昆虫细胞,制备重组杆状病毒。重组杆状病毒感染sf9细胞表达重组HA蛋白,通过western blot及IFA鉴定重组HA蛋白表达情况。结果表明,我们成功的构建了昆虫杆状病毒表达载体,该表达载体转染昆虫细胞后制备的重组杆状病毒病毒滴度较高,且重组杆状病毒感染细胞后表达获得重组HA蛋白,经western blot及IFA鉴定后,重组HA蛋白具有良好的免疫反应原性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 流感病毒研究进展
• 1.2 猪流感病毒流行病学
• 1.3 猪流感诊断技术研究进展
• 1.4 流感疫苗研究进展
• 1.5 杆状病毒表达系统的研究进展
• 1.6 目的与意义
• 第二章 甲型H1N1流感病毒HA蛋白原核表达
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论与小结
• 第三章 甲型H1N1流感病毒HA基因在昆虫细胞中的截短表达
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论与小结
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历