论文摘要
研究背景与目的:肝细胞癌（HCC）是威胁人类健康的重大疾病,侵袭转移是其主要生物学特点,也是造成患者主要的死亡原因。尽管近年来,在诊断方法和治疗手段方面取得了长足的进步,但由于侵袭转移的内在机制尚不明确,患者的生存时间仍无明显延长。因此有关侵袭转移的机制研究依然是HCC研究的关键问题。近年来,肿瘤细胞上皮-间叶样转变（EMT）、间叶样-上皮转变（MET）、肿瘤干细胞（CSCs）假说、肿瘤细胞与微环境的相互作用被认为与肿瘤的侵袭转移密切相关,成为探讨肿瘤侵袭转移机制的热点领域。现在认为EMT是实体肿瘤转移的起始环节。当肿瘤细胞发生EMT后,细胞间粘附降低,运动能力增强,利于肿瘤细胞脱离原发病灶,进入周围血管或淋巴管系统,成为肿瘤远处转移的前提。上述过程的逆过程叫做MET,是在形成转移灶过程中,微环境改变后,发生EMT转变的细胞逆转恢复上皮表型,从而有利于肿瘤细胞的定植和增殖,进而形成转移灶。低氧作为实体肿瘤微环境代表因素,也是实体肿瘤进展和治疗过程中普遍存在的现象。研究低氧与肿瘤细胞的相互作用,对探讨微环境对肿瘤侵袭转移的影响具有普遍意义。HCC作为一种在肝炎、肝硬化背景下发生的生长迅速、高转移的恶性肿瘤,无疑是研究低氧对肿瘤细胞影响的理想模型。本课题以低氧能否诱导肿瘤细胞发生EMT/MET转变为切入点,探讨低氧对HCC侵袭转移的影响及其可能的调控机制。研究假说:我们提出“低氧/复氧诱导HCC细胞发生可塑性转变,HIF1α是关键的调控因子”的理论假设。具体而言,即HCC细胞在原发灶由于低氧导致HIF1α稳定表达,通过与SNAI1启动子区HRE结合,直接上调SNAI1表达,诱导HCC细胞发生EMT转变,利于肿瘤细胞的侵袭转移。当肿瘤细胞到达合适器官或组织,环境氧浓度恢复,导致HIF1α快速降解,解除对SNAI1的作用,从而发生了间叶样转变的细胞重新恢复上皮细胞表型,细胞连接紧密,黏附力增强,运动能力减弱,则利于肿瘤细胞的定植和形成转移灶。HIF-1α在低氧诱导的HCC转变中可能起“枢纽分子”的作用,HIF1α-SNAI1-EMT信号通路可能是材料与方法:一、收集66例临床HCC组织标本并制作组织芯片（TMA）,通过免疫组化方法检测HIF1α、HIF2α、SNAI1、twist、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达,探讨其内在相关性,及其与临床病理因素间的相互关系。二、利用三气低氧培养箱构建体外HCC细胞低氧/复氧模型,采用光镜动态观察、细胞免疫荧光、qPCR、Western blot等方法在细胞形态、mRNA、蛋白水平检测细胞转变相关因子的表达变化。利用流式细胞仪检测细胞周期变化;利用Transwell小室观察细胞侵袭、运动能力的改变;利用平板克隆观察细胞增殖能力的变化。三、利用CoCl2模拟低氧环境,稳定HIF1α的表达,采用光镜动态观察、细胞免疫荧光、qPCR、Western blot的方法在细胞形态、mRNA、蛋白水平检测细胞转变相关因子的表达变化。四、采用分子克隆技术,构建重组HIF1αsiRNA- pSES-HUS质粒载体,并与腺病毒Adeasy骨架质粒重组为Ad-HIF1αsiRNA-pSES-HUS腺病毒载体,用其转染SMMC-7721肝癌细胞,通过qPCR、Western-blot、侵袭实验、运动实验,观察干扰HIF1α对肝癌细胞侵袭、运动能力的影响;五、通过基因转染、基因突变、分子克隆等技术构建系列5’端缺失的PGL3-Basic-SNAI1 Pro质粒及突变体质粒。通过双荧光素酶报告基因检测系统观察SNAI1启动子活性。探讨HIF1α与SNAI1之间的调控关系。结果及结论:1、在临床病理因素分析中发现,HIF1α的异常表达与EMT调控因子SNAI1表达在HCC中的表达明显高于正常肝组织,切显著相关。HIF-1α和SNAI1的表达与患者的预后、肿瘤侵袭转移明显相关。2、成功构建低氧/复氧诱导HepG-2和SMMC-7721肝癌细胞发生可塑性转变体外模型。证实低氧/复氧可诱导HepG-2和SMMC-7721肝癌细胞发生可塑性转变。3、100μM的CoCl2稳定HIF1α可以诱导HepG-2和SMMC-7721肝癌细胞发生可塑性转变。HIF1α可能是低氧/复氧诱导肝癌细胞发生可塑性转变的关键分子。4、分别成功构建了包含重组Ad-HIF1αsiRNA- pSES-HUS 4个腺病毒表达载体。成功筛选出有效的HIF1α干扰序列。干扰内源性HIF1α的表达,能有效抑制CoCl2诱导的SMMC-7721肝癌细胞EMT转变,降低肿瘤细胞的侵袭、运动能力。5、成功构建系列5’端缺失的PGL3-Basic-SNAI1 Pro质粒;成功构建系列5’端缺失含HRE突变体的PGL3-Basic-SNAI1 Pro质粒。通过双荧光素酶报告基因检测系统,证明HIF1α可能通过与SNAI1启动子HRE直接结合,调控细胞发生可塑性转变。6、肿瘤细胞在低氧/复氧状态下发生的细胞可塑性变化,可塑性现象与肿瘤干细胞的分化、去分化之间的关系怎样?可塑性是肿瘤干细胞独有的特点吗?肿瘤干细胞是一群固定的细胞,还是肿瘤细胞发生发展及侵袭转移中动态的过程?这些问题的回答,这将会引领课题更进一步深入研究。
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