中国牦牛瘤胃微生物来源的双功能木聚糖酶/内切葡聚糖酶的克隆及功能研究

论文摘要

木质纤维素是自然界中储量最丰富的可再生资源,是21世纪解决环境污染、食品短缺、能源危机的有效途径,而生物能源的技术瓶颈则是纤维素酶。为寻找新型、高效的木质纤维素酶,本研究利用宏基因组技术,对中国牦牛瘤胃微生物纤维素降解酶基因资源进行了研究。在本研究中,通过对中国牦牛瘤胃宏基因组cosmid文库的活性筛选,获得能够水解羧甲基纤维素钠（CMC）的阳性克隆,进一步通过构建亚克隆、测序、同源比对的方法获得内切葡聚糖酶基因RuCelA的cds序列,该基因编码区长1656bp,编码了551个氨基酸,分子量约60kD,隶属于纤维素水解酶家族5。利用大肠杆菌表达获得重组蛋白RuCelA,并对其进行了酶学属性的研究。以CMC为底物时,其内切葡聚糖酶活性在50℃、pH=5.0时酶的活性最高；而以木聚糖为底物时,其木聚糖酶活性在65℃、pH=7.0时活性达到最大。Co+、Co2+可以明显提高RuCelA内切葡聚糖酶活性,却抑制木聚糖酶活性。通过对大麦葡聚糖、木聚糖等底物的非完全水解产物按时取样进行TLC分析,证实了RuCelA内切葡聚糖酶及木聚糖酶的水解模式均为内切模式,通过对完全水解产物的TLC及HPAEC分析发现二糖、三糖、四糖为主要水解产物,伴随有少量单糖。RuCelA可以水解糖类的最小聚合度为三糖。在底物特异性研究中发现,RuCelA对滤纸有一定的水解活性,RuCelA对含有β-1,3/4糖苷键的大麦葡聚糖及地衣多糖底物有非常高的降解能力,对含有β-1,4糖苷键的底物如木聚糖、羟乙基纤维素、CMC等底物具有一定的降解能力,而对不含β-1,4糖苷键的底物,如只含β3-1,3糖苷键的葡聚糖及含β-1,3/6糖苷键的海藻多糖,并无降解能力。RuCelA可以与葡萄糖苷酶及木糖苷酶在对大麦葡聚糖及木聚糖的水解过程中表现出明显的协同作用。此外,利用双功能RuCelA可以在45℃实现对碱预处理的木质纤维素长达14天的单酶降解,得到的还原糖浓度要高于同酶活水平下的单功能酶,并与单功能酶混合使用时得到的还原糖浓度基本持平。这说明,双功能酶RuCelA可以作为两种单功能酶的替代物而广泛应用于木质纤维素的糖化过程,如制备生物乙醇等。同时成功筛选得到了表达此蛋白的毕赤酵母工程菌,实现了重组蛋白的高水平表达。

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Abstract

1 前言

1.1 生物能源开发的重要性及现状

1.2 木质纤维素的酶降解系统

1.3 开发瘤胃微生物纤维素酶的意义及研究进展

1.4 双功能木聚糖酶/内切葡聚糖酶研究进展

1.5 题背景和研究内容

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株

2.1.2 质粒

2.1.3 引物

2.1.4 主要试剂

2.1.5 主要仪器设备

2.1.6 培养基和常用溶液

2.2 方法

2.2.1 分子克隆实验技术

2.2.1.1 PCR

2.2.1.2 酶切反应体系

2.2.1.3 连接反应

2.2.1.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2.2.1.5 大肠杆菌转化子鉴定和测序

2.2.1.6 质粒小型抽提

2.2.1.7 质粒大型抽提

2.2.1.8 琼脂糖电泳DNA片段回收

2.2.1.9 SDS-PAGE蛋白电泳

2.2.2 Cosmid质粒DNA的亚克隆文库的构建及筛选

2.2.3 生物信息学分析

2.2.3.1 蛋白同源性及进化树分析

2.2.3.2 蛋白结构域分析

2.2.4 大肠杆菌内重组蛋白的诱导表达

2.2.5 大肠杆菌内重组蛋白的Ni-NTA亲和纯化

2.2.6 酵母工程菌筛选及蛋白表达纯化

2.2.6.1 毕赤酵母表达质粒的构建

2.2.6.2 毕赤酵母感受态细胞的制备及电转化

2.2.6.3 酵母转化子的鉴定

2.2.6.4 高分泌表达毕赤酵母工程菌的筛选

2.2.6.5 蛋白表达产物的透析纯化

2.2.7 RuCelA内切葡聚糖酶及木聚糖酶活性的酶学属性研究

2.2.7.1 葡萄糖、木糖标准曲线的绘制

2.2.7.2 酶活及最适温度、最适pH值测定、酶的热稳定性

2.2.7.3 酶动力学参数的测定

2.2.7.4 金属离子对酶活的影响

2.2.7.5 酶的底物特异性测定

2.2.7.6 酶解产物的TLC及HPAEC分析

2.2.8 酶的功能研究

2.2.8.1 酶的协同作用分析

2.2.8.2 酶对预处理稻草的水解

3 结果

3.1 Cosmid文库插入外源DNA片段的分析

3.2 内切葡聚糖酶阳性克隆的筛选及RuCelA基因的序列分析

3.3 RuCelA在大肠杆菌内的重组表达

3.4 重组RuCelA的酶学属性分析

3.4.1 酶的最适条件、热稳定性、pH稳定性及动力学分析

3.4.2 金属离子对RuCelA酶活的影响

3.4.3 RuCelA的底物特异性

3.4.4 RuCelA的水解模式分析

3.5 重组RuCelA的功能研究

3.5.1 RuCelA与木糖苷酶xyl1、葡萄糖苷酶Bgl间的协同作用

3.5.2 RuCelA与木聚糖酶Xyn-CDBFV、葡聚糖酶RuCelB对预处理稻草的水解能力比较

3.5.3 RuCelA水解木聚糖、大麦葡聚糖及预处理稻草的产物分析

3.6 毕赤酵母内重组目的蛋白的表达

3.6.1 酵母表达工程菌的构建

3.6.2 高拷贝菌株的筛选和重组蛋白在酵母中的表达

3.6.3 与大肠杆菌表达重组蛋白间的比较

4 讨论

4.1 瘤胃宏基因组文库的功能筛选

4.2 RuCelA的酶学属性

4.3 RuCelA的功能研究

4.4 稻草预处理策略

4.5 酵母表达重组蛋白的优势及劣势

5 结论

参考文献

致谢

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