论文摘要
目的：构建靶向AQP3的siRNA表达载体,研究其对XWLC-05肺癌细胞系AQP3基因和蛋白表达的影响,并进一步通过体内外实验验证RNA干扰对XWLC-05肺癌细胞水通道蛋白3表达的影响。方法：搜索Genbank中人APQ3基因序列,筛选出最优的siRNA靶序列,再根据pSilencer 4.1-CMV neo siRNA表达载体的特点,设计出相应的具有发夹结构的siRNA合成模板,利用pSilencer4.1-CMV质粒构建AQP3特异性siRNA表达载体和对照组表达载体,并用PCR电泳鉴定。AQP3特异性siRNA表达载体以脂质体法转染XWLC-05肺癌细胞48小时,观察细胞的形态变化,用RT-PCR检测AQP3 mRNA的表达水平,用Western blot方法检测APQ3蛋白的表达水平。应用靶向AQP3的siRNA质粒表达载体转染XWLC-05肺癌细胞24h、48h、72h,用MTS法检测XWLC-05肺癌细胞的增殖活性；流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化及凋亡情况；Matrigel穿膜法检测RNAi对肿瘤细胞侵袭性的影响；转染后48h检测RNAi介导AQP3基因沉默对XWLC-05细胞MMP-2、MMP-9活性的影响,探讨其可能的机制；通过以上研究了解RNAi在体外对肺癌细胞增殖及侵袭性的影响。再通过皮下注射XWLC-05肺癌细胞和RNAi介导AQP3基因沉默的XWLC-05肺癌细胞建立裸鼠移植瘤模型,观测裸鼠一般情况、实验前后体重变化、实验结束时血常规情况、成瘤率,并定时测量肿瘤长短径,计算肿瘤体积,并根据肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线、移植瘤组织病理学观察以及免疫组化检测各组移植瘤组织中AQP3的表达情况,探讨RNAi在体内对肺癌细胞增殖及侵袭性结果：成功构建靶向AQP3的siRNA表达载体1和2,分别命名为pAQP3-siRNA1、pAQP3-siRNA2。转染48小时后,pAQP3-siRNA1和pAQP3-siRNA2转染组AQP3 mRNA表达量分别是对照组的65%和79%,组间差异具有统计学意义（P<0.05）；pAQP3-siRNAl和pAQP3-siRNA2转染目的基因后的蛋白表达量分别是对照组的53%和73%,pAQP3-siRNA1干扰效果明显高于pAQP3-siRNA2（P<0.05）,RNA水平的检测与蛋白水平的检测结果一致。转染后24小时,XWLC-05细胞增殖无明显受抑制（P>0.05）,然而转染48小时及72小时后,XWLC-05细胞增殖明显受抑制,差异有统计学意义（P<0.05）；与对照组、空质粒组相比,实验组XWLC-05肺癌细胞G1期细胞百分比明显增加,存在组间差异,有统计学意义（P<0.05）,并且实验组有明显的凋亡峰形成；与对照组相比,实验组XWLC-05细胞有侵袭能力并能穿过人工基底膜的细胞数呈下降趋势,差异有统计学意义（P<0.05）,且转染后48h、72h与转染后24h相比,差异有统计学意义（P<0.05）,转染后48h与72h相比,无统计学差异（P>0.05）；实验组洗脱液OD值与转染空白质粒组、对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）；与转染空白质粒组、对照组相比,实验组肺癌细胞MMP-2的活性明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。成功建立裸鼠移植瘤模型。裸鼠于实验结束后全部存活；实验组及对照组裸鼠体重均有不同程度增加,但组间差异无统计学意义（P>0.05）。血常规检查：实验组红细胞略高于对照组（P<0.05）,两组白细胞、血小板数值相近,无统计学差异（P>0.05）。裸鼠一般于接种XWLC-05细胞后7～10天开始出现肉眼可见的移植瘤,实验组20只裸鼠有15只成瘤,成瘤率达75%；对照组20只裸鼠有16只成瘤,成瘤率80%,两组相比,无统计学差异（P>0.05）,对照组肿瘤生长曲线较陡,上升幅度较大；实验组肿瘤生长呈下降趋势；移植瘤组织病理学检查：对照组可见癌细胞形成癌巢,其中可见腺管、腺腔样结构,肿瘤细胞大小不等,异型性明显,细胞核增大,核染色质深染,核膜增厚,易见病理性核分裂像。实验组肿瘤细胞数量减少,可见片状坏死,细胞分裂像相对少见,部分核固缩、碎裂、崩解,间质内可见纤维组织增生,并可见炎细胞浸润。免疫组化：AQP3主要存在于细胞膜及细胞浆,免疫组化阳性染色为棕色,实验组染色强度明显低于对照组。结论：AQP3特异性siRNA能够有效地抑制XWLC-05肺癌细胞AQP3的表达,在体外可有效抑制XWLC-05肺癌细胞的增殖与侵袭,其机制可能是调节肿瘤细胞的增殖周期并诱导细胞凋亡来限制肿瘤细胞的增殖,并且APQ3基因表达水平降低影响了肿瘤细胞MMP-2酶的.活性,导致了肺癌细胞的浸润和转移能力降低；在体内可有效抑制裸鼠移植瘤的生长,加速肿瘤细胞的坏死和凋亡。
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