禽流感病毒感染鸡的病毒定位及基因差异表达研究

论文摘要

禽流感（Avian Influenza，AI）是由A型流感病毒（Avian Influenza virus，AIV）引起的一种禽类的感染和／或疾病综合征。近年来，AI的流行愈演愈烈，特别是2003年至今，该病已经从亚洲蔓延到欧洲和非洲。自1997年香港AIV感染人事件以来，已有近百人被发现死于AIV感染，而且仍不断有新病例出现。科学家们预测AI的流行可能会再次引发人类流感的大暴发。目前对AI的研究热点集中在病毒基因的克隆、病毒的检测方法研究、疫苗的研制等方面，而针对AI的基础研究的报道不多，且研究方向大多为AIV对人的影响。迄今为止，关于AIV对天然宿主鸡致病机制的研究，仍停滞在组织和细胞水平。对AIV感染过程中宿主的应答机制，感染后引起动物快速死亡的分子机制，宿主细胞蛋白和病毒蛋白之间的相互作用及其意义，以及不同毒力AIV在宿主体内的分布规律等方面的研究并不多见。弄清AIV对鸡的致病机制，不仅有助于防制动物的AIV感染，而且对研究AIV对人的感染机制也有重要的参考意义。为进一步研究AIV的致病机制，作者对AIV抗原在鸡体内的分布规律，AIV感染过程中鸡的基因差异表达，以及宿主蛋白和病毒蛋白之间的相互作用等进行了研究。主要工作和研究结果如下：1 原位杂交检测禽流感病毒方法的建立 以A／V感染MDCK培养细胞，建立了感染模型。通过RT-PCR扩增大小为543bp的病毒核蛋白（NP）基因的保守片段，经地高辛标记，制备NP基因核酸探针，建立了AIV的细胞原位杂交检测方法。通过对原位杂交条件的优化，使该检测方法具有了良好的特异性、敏感性和可重复性。该方法的建立为AIV的精确定位和研究其致病机制提供了较好的选择。2 禽流感病毒感染鸡的病毒定位 以低致病性AIV感染鸡，建立病理模型，取各器官组织制备石蜡切片。利用原位杂交检测AIV，研究病毒在组织内的分布。结果显示，AIV在感染鸡以后，病毒抗原主要分布于肠上皮细胞、喉和气管软骨细胞的基质以及肺泡壁上皮细胞内，而且只能在感染初期检测到病毒核酸，其他的内脏器官内则始终检测不到病毒核酸。试验表明，低致病性AIV只能存在于实质器官以外的器官组织，并很快被宿主清除。AIV抗原在喉和气管软骨细胞的基质内的出现，是本试验的一个新发现，这可能是病毒躲避宿主免疫的一种手段。3 鸡对禽流感病毒感染应答基因的筛选与鉴定 通过高致病性AIV感染鸡，建立了试验动物模型。利用抑制性差减杂交技术，成功构建了AIV感染过程中鸡的肾脏组织双向差减cDNA文库。通过PCR和斑点杂交，从文库中筛选出271个差异克隆，经序列测定共获得205个差异表达EST。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 禽流感和禽流感病毒研究进展
• 1.1 禽流感的流行和危害
• 1.1.1 国外禽流感的流行现状
• 1.1.2 国内禽流感的流行现状
• 1.1.3 禽流感的危害
• 1.2 禽流感病毒及其特性
• 1.2.1 禽流感病毒的形态和结构
• 1.2.2 禽流感病毒的理化特性
• 1.2.3 禽流感病毒的复制
• 1.2.4 禽流感病毒的宿主特异性
• 1.2.5 禽流感病毒的免疫原性
• 1.3 禽流感病毒的分子生物学
• 1.3.1 病毒基因编码蛋白的结构和功能
• 1.3.2 禽流感病毒的分子进化
• 1.3.3 禽流感病毒宿主间跨越的分子基础
• 1.4 禽流感的检测方法
• 1.4.1 病毒的分离鉴定
• 1.4.2 凝（HA）和血凝抑制（HI）试验
• 1.4.3 神经氨酸酶抑制试验（NIT）
• 1.4.4 琼脂凝胶扩散试验（AGID）
• 1.4.5 病毒中和试验（NT）
• 1.4.6 免疫荧光技术（IFT）
• 1.4.7 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 1.4.8 分子生物学诊断技术
• 1.5 禽流感病毒的致病机制
• 1.5.1 禽流感病毒的毒力
• 1.5.2 禽流感病毒与细胞凋亡
• 2 动物的抗病毒机制
• 2.1 抗病毒的特异性免疫应答
• 2.2 非特异性免疫细胞
• 2.3 干扰素抗病毒机制
• 2.3.1 干扰素的种类和特性
• 2.3.2 干扰素抗病毒的分子机制
• 2.3.3 IFN刺激基因的诱导和调控
• 2.3.4 IFN诱导ISG的途径
• 2.3.5 IFN诱导的抗病毒蛋白
• 3 流感病毒感染过程中宿主的应答基因
• 4 差异表达基因的筛选方法及其应用
• 4.1 差异表达基因的筛选方法
• 4.1.1 消减杂交法
• 4.1.2 mRNA差异显示
• 4.1.3 代表性差别分析法
• 4.1.4 抑制性差减杂交
• 4.2 抑制性差减杂交技术在筛选疾病相关基因中的应用
• 5 本研究的目的、意义和试验总体设计
• 第二章 禽流感病毒原位杂交检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 主要仪器
• 1.2 试剂
• 1.3 病毒
• 1.4 细胞
• 1.5 核酸探针的制备
• 1.5.1 引物设计合成
• 1.5.2 禽流感病毒RNA提取
• 1.5.3 RT-PCR扩增NP基因片段
• 1.5.4 DNA片段的回收
• 1.5.5 地高辛标记NP基因片段
• 1.5.6 探针标记效率与灵敏度测定
• 1.5.7 探针特异性鉴定
• 1.6 细胞涂片的制备
• 1.6.1 细胞培养与病毒感染
• 1.6.2 载玻片的准备
• 1.6.3 细胞收集与涂片
• 1.6.4 细胞接毒后病毒检测
• 1.7 原位杂交
• 1.7.1 细胞的固定
• 1.7.2 蛋白酶K消化
• 1.7.3 DNA酶消化
• 1.7.4 原位杂交
• 1.8 原位杂交方法的重复性试验
• 2 结果与分析
• 2.1 禽流感病毒NP基因片段的RT-PCR扩增结果
• 2.2 地高辛标记效率与灵敏度检测结果
• 2.3 探针特异性检验
• 2.4 MDCK细胞接毒后的检测
• 2.5 禽流感病毒的细胞内原位杂交检测
• 2.6 原位杂交方法的重复性试验
• 3 讨论
• 3.1 禽流感病毒原位杂交检测方法的建立及其意义
• 3.2 原位杂交方法的影响因素
• 3.2.1 原位杂交标本的固定
• 3.2.2 原位杂交标本组织的通透性处理
• 3.2.3 原位杂交的探针制备
• 4 小结
• 第三章 禽流感病毒感染鸡的病毒定位
• 1 材料与方法
• 1.1 主要仪器
• 1.2 试剂
• 1.3 病毒
• 1.4 试验动物
• 1.5 病毒增殖
• 1.6 病毒半数感染量的测定
• 1.7 动物感染试验
• 1.8 组织样品的采集与固定
• 1.9 石蜡组织切片的制备
• 1.9.1 载玻片和盖玻片的处理
• 1.9.2 组织包埋
• 1.9.3 组织切片的制备
• 1.10 禽流感病毒NP基因核酸探针的制备
• 1.11 原位杂交
• 2 结果与分析
• 2.1 禽流感病毒感染后的鸡的临床症状及剖检变化
• 2.2 原位杂交结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 鸡对禽流感病毒感染应答基因的筛选与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 主要仪器
• 1.2 试剂
• 1.3 试验动物
• 1.4 病毒
• 1.5 动物饲养与病毒感染
• 1.6 试验组织样本的采集
• 1.7 组织总RNA的提取
• 1.8 mRNA的分离
• 1.9 SMART cDNA的合成
• 1.10 差减cDNA文库构建
• 1.10.1 Driver和Tester cDNA的制备
• 1.10.2 差减杂交
• 1.10.3 PCR扩增
• 1.10.4 Tester cDNA的接头连接效率和文库差减效率的检测
• 1.10.5 差减cDNA质粒文库的构建
• 1.11 差减cDNA克隆的筛选
• 1.11.1 PCR筛选
• 1.11.2 斑点杂交筛选
• 1.12 阳性克隆cDNA片段测序及序列分析
• 1.13 RT-PCR检验差异表达基因
• 1.13.1 差异表达基因引物的设计与合成
• 1.13.2 RT-PCR检验
• 1.14 Northern杂交检验差异表达基因
• 1.14.1 探针标记
• 1.14.2 甲醛变性电泳分离RNA
• 1.14.3 转膜
• 1.14.4 杂交
• 1.15 ISG12和LY6E基因在禽流感病毒感染鸡不同组织中的表达分析
• 1.16 ISG12和LY6E基因克隆及序列分析
• 1.16.1 ISG12和LY6E基因克隆
• 1.15.2 ISG12和LY6E基因序列的分析
• 2 结果与分析
• 2.1 组织总RNA的提取
• 2.2 mRNA的分离
• 2.3 Driver cDNA和Tester cDNA的制备
• 2.4 鸡对禽流感病毒感染应答基因差减cDNA文库的构建
• 2.5 差减cDNA文库的差减效率检测
• 2.6 差减cDNA克隆的筛选
• 2.6.1 PCR筛选
• 2.6.2 斑点杂交筛选
• 2.7 阳性克隆cDNA片段测序及序列分析
• 2.8 差异表达基因的RT-PCR检验和Northern杂交检测
• 2.9 Northern杂交检验ISG12和LY6E基因在鸡的不同组织中的表达
• 2.10 鸡ISG12和Lv6E基因克隆及序列分析
• 2.10.1 鸡ISG12基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的分析
• 2.10.2 鸡ISG12蛋白分子进化树分析
• 2.10.3 鸡LY6E基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的分析
• 2.10.4 鸡LY6E蛋白分子进化树分析
• 3 讨论
• 3.1 鸡禽流感病毒感染应答基因的筛选鉴定及其意义
• 3.1.1 ISG12基因
• 3.1.2 LY6E基因
• 3.1.3 溶菌酶基因
• 3.1.4 基质Gla蛋白基因
• 3.1.5 谷光苷肽转移酶基因
• 3.1.6 葡萄糖6磷酸酶催化亚基基因
• 3.1.7 酒精脱氢酶基因
• 3.1.8 突触结合蛋白基因
• 3.1.9 钠／二羧酸转运蛋白基因
• 3.1.10 禽流感病毒感染鸡的机制
• 3.2 抑制性差减杂交技术的应用
• 3.2.1 抑制性差减杂交技术在筛选疾病相关基因中的应用
• 3.2.2 应用SSH筛选鸡对禽流感病毒感染的应答基因
• 3.2.3 鸡对禽流感病毒感染应答基因的鉴定以及cDNA序列的完整性
• 3.2.4 RT-PCR分析宿主应答基因的表达
• 4 小结
• 第五章 禽流感病毒NS1蛋白与鸡差异表达蛋白间的相互作用
• 1 材料与方法
• 1.1 主要仪器
• 1.2 试剂
• 1.3 质粒
• 1.3.1 pBT质粒
• 1.3.2 pTRG质粒
• 1.3.3 对照质粒
• 1.4 重组诱饵质粒的构建
• 1.4.1 NS1基因的克隆
• 1.4.2 插入片段的准备
• 1.4.3 诱饵质粒和插入片段的连接和转化
• 1.4.4 阳性转化子的验证
• 1.4.5 NS1蛋白和λ噬菌体阻遏蛋白λcI融合蛋白的诱导表达
• 1.5 重组目标质粒的构建
• 1.5.1 LY6E和ISG12基因的克隆
• 1.5.2 插入片段及目标质粒的准备
• 1.5.3 目标质粒和插入片段的连接与转化
• 1.5.4 阳性转化子的验证
• 1.5.5 ISG12、LY6E蛋白和RNA聚合酶a-亚基氨基末端融合蛋白的诱导表达
• 1.6 重组诱饵质粒和目标质粒的共转化
• 1.6.1 重组诱饵质粒和目标质粒的制备
• 1.6.2 重组诱饵质粒和目标质粒的共转化
• 1.6.3 阳性共转化子的鉴定
• 1.6.4 阳性共转化子的第一轮筛选
• 1.6.5 阳性共转化子第二轮筛选
• 2 结果
• 2.1 重组诱饵质粒的构建
• 2.1.1 NS1基因的RT-PCR扩增、克隆与鉴定
• 2.1.2 NS1基因的序列分析
• 2.1.3 重组诱饵质粒的构建
• 2.1.4 NS1蛋白和λ噬菌体阻遏蛋白λcI融合蛋白的诱导表达
• 2.2 重组目标质粒的构建
• 2.2.1 LY6E和ISG12基因的PCR扩增及克隆
• 2.2.2 LY6E和ISG12基因的序列测定
• 2.2.3 目标质粒与LY6E、ISG12基因片段的连接与转化
• 2.2.4 转化子的PCR鉴定和酶切鉴定
• 2.2.5 ISG12、LY6E蛋白和RNA聚合酶a-亚基氨基末端融合蛋白的诱导表达
• 2.3 重组诱饵质粒和重组目标质粒的共转化
• 2.4 阳性共转化子的筛选
• 3 讨论
• 3.1 NS1蛋白和ISG12蛋白、LY6E蛋白之间的相互作用
• 3.2 关于细菌双杂交系统
• 4 小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表论文