hPEBP4促进肿瘤细胞ERa介导的转录活化的研究

论文摘要

人磷脂酰乙醇胺结合蛋白-4（Human phosphatidylethanolamine-bindingprotein-4,hPEBP4）是我们实验室自主发现并命名的新分子,其高表达于乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌细胞和组织。我们以前的研究集中于hPEBP4和肿瘤细胞凋亡的关系上,证明肿瘤细胞中的hPEBP4能通过抑制ERK1/2、JNK的活化以及促进Akt的激活来发挥抵抗TNFα和TRAIL诱导的凋亡的作用。为了更加全面地了解hPEBP4与肿瘤的关系,我们推测作为在肿瘤细胞相对特异性高表达的基因,hPEBP4的上调可能是肿瘤细胞适应体内环境不断进化演变的结果,也就是说hPEBP4在肿瘤细胞内相对特异性的高表达对肿瘤细胞而言究竟有什么意义呢?hPEBP4高表达于乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌,我们从hPEBP4的表达谱入手,推测其很可能参与肿瘤细胞对微环境中的性激素的反应。在本课题中,我们选取雌激素信号通路作为研究对象,首次探讨了hPEBP4在肿瘤细胞雌激素信号通路中的作用及其机制。为了确认hPEBP4是否在雌激素通路中发挥作用,我们用报告基因检测hPEBP4对雌激素受体α（estrogen recpeptor alpha,ERα）介导的转录活性的作用。人乳腺癌细胞MCF-7高表达hPEBP4,在MCF-7细胞中成功干扰hPEBP4的表达后,我们发现细胞内报告基因荧光强度明显下降。分别用real-time PCR和Western blot检测ERα下游的两个靶基因pS2和Cyclin D,发现hPEBP4的沉默显著性地削弱了雌激素诱导的肿瘤细胞内ERα下游的pS2和Cyclin D1的表达。ERα作为转录因子激活转录是雌激素信号通路最主要和经典的部分,所以这些结果表明hPEBP4参与了雌激素信号通路的活化,该分子的沉默会显著降低乳腺癌细胞ERα通路转录活性。为了寻找hPEBP4促进ERα通路活化的机制,我们用染色质免疫共沉淀的技术观察ERα在雌二醇（E2）的刺激下与靶基因启动子ER顺势作用元件（ERE）结合的情况。结果发现,在干扰hPEBP4后,ERα受E2激活、招募并结合到ERE的数量显著减少。表明hPEBP4对ERα通路活化的调控与跟启动子结合的ERα的数量下降有关。为了进一步研究hPEBP4导致招募到ERE的ERα数量减少的机制,我们检测了干扰hPEBP4对ERα蛋白水平的影响。Western blot的结果表明,在E2刺激2h、6h后,ERα的蛋白水平呈一定程度的升高,但与干扰对照组相比,hPEBP4的干扰明显降低了ERα的表达量。考虑到蛋白酶体依赖的ERα的降解是ERα通路调控的重要机制,我们用MG132来抑制蛋白酶体的降解功能,发现加入MG132可以使ERα蛋白水平在E2的刺激下迅速升高,而且hPEBP4的干扰对于ERα上升的抑制作用消失。那么,是不是相应的ERα的转录功能也发生了类似的变化呢?我们用带ERE的报告基因检测了上述处理后的转录活性,发现MG132可以完全逆转干扰hPEBP4导致的ERα转录活性的降低。最后,我们还用瞬时转染ERα真核表达质粒的方法显著逆转了干扰组的转录活性,从而证明hPEBP4确实是通过抑制蛋白酶体对ERα的降解来促进雌激素对肿瘤细胞转录活性的激活。受到凋亡信号的刺激,hPEBP4从细胞浆溶酶体到细胞膜的转位进而调控MAPK和Akt等信号分子的活化,我们以往的工作证明这是其抗凋亡作用的重要机制。那么,是否在雌激素信号通路中hPEBP4也具有这种功能呢?于是,我们检测了E2刺激下MCF-7细胞的ERK1/2和JNK的磷酸化情况,发现E2能够激活ERK1/2和JNK,而hPEBP4的干扰则显著的增强E2的这种活化作用。相对而言,E2对Akt的活化作用较微弱,干扰hPEBP4使Akt的磷酸化水平降低。另外,细胞浆免疫共沉淀的结果也证明细胞膜ERα可以和hPEBP4发生相互作用。上述结果表明hPEBP4参与了极少数ERα介导的非经典的膜信号通路的调控。那么是否hPEBP4对ERα经典的转录活性的调控就是通过对非经典的膜信号通路的作用而实现的呢?为了验证这个假设,我们用U0126和LY294002分别阻断ERK和PI-3K信号通路,然后观察ERα的报告基因转录活性的变化。我们发现,ERK和PI-3K的阻断并不能取消hPEBP4对ERα转录激活功能的促进作用,表明hPEBP4参与对膜ERα信号通路包括MAPK和PI-3K的调控,但是后者不参与hPEBP4对经典的ERα介导的转录活性的调控。最后,我们想知道hPEBP4的这种对ERα的转录活性调控作用是否只局限于MCF-7细胞。于是,我们构建了过表达hPEBP4的稳定筛选的HeLa细胞并用瞬时转染pSG5-ERα的方法赋予该细胞对E2的反应性。结果发现与空载体对照细胞相比,过表达hPEBP4的HeLa细胞具有更强的报告基因转录活性,并且ERα蛋白表达水平更高。当加入蛋白酶体抑制剂MG132后,ERα蛋白水平的差异消失。这一结果说明,hPEBP4对ERα介导的转录功能的调控在肿瘤细胞中存在广泛性。综上所述,我们通过分别在MCF-7和HeLa细胞中RNA干扰和稳定过表达hPEBP4,证明hPEBP4能通过抑制蛋白酶体依赖的ERα的降解而显著促进ERα介导的转录活性,从而首次揭示了hPEBP4参与肿瘤细胞雌激素信号通路的活化,本实验也为ERα介导的信号通路的调控机制增加了新的内容。人磷脂酰乙醇胺结合蛋白-4（Human phosphatidylethanolamine-bindingprotein-4,hPEBP4）是一个我们实验室发现并克隆的“新基因”,在乳腺癌细胞中高水平表达,具有抵抗凋亡的作用。前期的报道已经证实了用siRNA沉默hPEBP4的表达后,乳腺癌对TNF-α的敏感性明显增强,前列腺癌对TRAIL的敏感性也有较大的提高。然而RNA干扰技术要运用于体内甚至临床还存在许多障碍,而小分子化合物作为抑制剂则具有技术平台成熟、口服即可吸收、不易降解、起效快等优点,所以我们与中科院药物所合作拟开发一个能特异性阻断hPEBP4的小分子化合物,希望能在前面机制研究的基础上做一些治疗性研究的有益探索。一、小分子化合物的发现因为目前仍缺乏一个确切的关于hPEBP4的晶体衍射的结果,所以我们根据已知的同源分子采取了同源模建的方法来建立hPEBP4分子的三维结构模型。用hPEBP4的基因登录号（AY037148）搜索PDB的同源蛋白序列（http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/）,发现三个同源分子牛PEBP-1（PDB登录号1A44）,小鼠PEBP-2（登录号1KN3）,人PEBP-1（登录号1BEH）。以这三个同源分子为参考,我们用多序列结构对比软件InsightⅡ结合人工调整勾勒出hPEBP4分子的最有可能的三维结构模型。最后运用Powell软件从能量角度优化并验证该模型。我们选用SPECS化合物库,对超过270000个小分子化合物逐一进行了筛选。具体的方法是先用Dock4.0将小分子逐一跟hPEBP4的3D模型进行对接,淘汰结合不太紧密的小分子,此轮筛选留下8700个小分子。然后,用另外一个叫Flex的软件对这些候选分子打分选取前600个。接着用autodock3.05进行hPEBP4和化合物的自动对接,并依据类药性原则将一些不符合药物特征的化合物淘汰,最后得到83个最佳分子进行合成。合成好的83个候选化合物先用表面等离子共振（SPR）技术筛选出确实能跟靶标蛋白hPEBP4结合的化合物。SPR是检测蛋白等生物大分子相互之间及大分子与小分子相互作用的一种生物传感器。在这里我们把融合蛋白GST-hPEBP4耦连在CM5芯片上,然后把化合物小分子溶解在溶液中以流动相流经芯片表面,根据不同浓度化合物与蛋白结合能力（近似反映为Biacore的RU值）的不同来计算平衡解离常数,从而得到两者结合性的信息。运用这种方法,我们最终拿到了7个跟hPEBP4结合最强的小分子并用MTT的方法初步观察其抑制乳腺癌细胞增值的能力。与TNF-α（20ng/mL）联合作用,只有命名为DC240016和DC240042的两个小分子化合物表现出跟TNF-α协同抑制MCF-7细胞增值的能力。由于前者单独应用即表现出明显的毒性,故最终决定用DC240042开展下面的生物学试验进一步确证其抗肿瘤功能。二、DC240042抗肿瘤活性的鉴定以前的研究已经证明hPEBP4抵抗TNF-α引起的细胞凋亡跟其与Raf-1和MEK1相互作用,进而阻断ERK1/2和JNK的活化有关。所以为了排除化合物非特异性杀伤造成MTT阳性结果的可能,我们用TNF-α刺激MCF-7细胞后用免疫印记的方法检测ERK1/2和JNK的磷酸化情况,发现TNF-α可以引ERK和JNK的磷酸化,而预先加入了DC240042的细胞ERK1/2和JNK的磷酸化程度进一步增强。免疫共沉淀发现DC240042导致hPEBP4跟Raf-1及MEK1的作用明显减弱。这些数据说明DC240042可以从分子机制上逆转hPEBP4的作用。然后,我们用R123/PI标记的方法利用流式细胞仪研究DC240042对凋亡的作用。结果显示DC240042可以显著增强MCF-7细胞对TNF-α的敏感性。再用另外一对凋亡标记探针AnnexinV/PI检测发现DC240042跟不同浓度的TNF-α（10,20,50ng/mL）联合作用都具有对后者的增敏作用。流式细胞仪的结果还显示DC240042的这种增强凋亡的作用具有浓度和时间的依赖性。接着,我们检测DC240042对不表达hPEBP4的细胞L929是否具有促凋亡作用。流式结果显示DC240042没有对L929细胞表现出增强TNF-α凋亡作用的效应。为了排除细胞之间因遗传背景差异造成的L929细胞阴性结果,我们用RNAi沉默了MCF-7细胞中hPEBP4的表达,然后观察DC240042是否仍具有上面描述的放大TNF-α凋亡效应的作用。结果显示,RNAi可以极大增强MCF-7对TNF-α的敏感性（近三倍）,但hPEBP4沉默后的MCF-7细胞对DC240042不再具有反应性。上面两个试验结果说明DC240042对TNF-α的协同效应是依赖于hPEBP4的,所以DC240042是靶向于hPEBP4的小分子抑制剂。因为缺乏一个成熟的乳腺癌TNF-α体内治疗的模型,我们进一步用软琼脂克隆形成试验考察了DC240042对MCF-7生长抑制作用。结果表明,TNF-α对MCF-7的克隆形成能力具有一个明显的抑制作用,与DC240042的联合应用则进一步增强了这种抑制作用。以前我们曾经报道了hPEBP4在前列腺肿瘤细胞抵抗TRAIL引发的凋亡过程中亦起了一定的作用。所以最后我们检测了DC240042与TRAIL联合运用对LnCap细胞的凋亡诱导作用。流式细胞检测结果表明,与单独用TRAIL相比,DC240042的联用显著增强了细胞的凋亡百分比。

论文目录

• 缩略词表
• 学位论文一:hPEBP4通过抑制蛋白酶体依赖的雌激素受体α的降解而促进肿瘤细胞雌激素受体α介导的转录活性的研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 正文
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 学位论文二:靶向于hPEBP4的小分子化合物的发现及抗肿瘤功能的鉴定
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 正文
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 文献综述:针对凋亡的靶向治疗
• 致谢
• 附录