创伤性深静脉血栓形成与不形成差异表达基因研究

论文摘要

目的在建立大鼠创伤性肢体深静脉血栓形成动物模型的基础上，利用基因芯片技术研究创伤性深静脉血栓形成过程及血栓高峰期血栓形成与不形成两种状态下股静脉的基因表达变化，并对高峰期两种病理状态对比下的差异表达基因进行分析，以寻找创伤性深静脉血栓形成部分相关关键基因及分子标志物。材料与方法1、分组：将150只SD大鼠随机选取10只作为正常对照组（A组，n＝10），其余140只实验大鼠，根据造模后的不同时相点、血栓形成情况分为7组：创伤即刻组（B组），血栓形成前期组（C组），高峰期血栓形成组（D组），高峰期血栓不形成组（H组），血栓消退组（E组），血栓不消退组（F组）和血栓不形成组（G组）。2、造模：采用定量击打大鼠双侧大腿外侧（大转子下1cm）＋双侧髋人字石膏固定的方式对B组、C组、D组、H组、E组、F组和G组大鼠进行造模，建立创伤性肢体深静脉血栓形成动物模型。打击能量5焦耳（J）。造模后，除A、B组外大鼠均行石固定。3、取材：根据预试验中血栓形成情况，于血栓形成过程中的相应时相点切取大鼠股静脉血管。试验大鼠用3％的戊巴比妥钠溶液按1ml／kg体重进行腹腔麻醉，仰卧位固定，消毒，暴露双侧股静脉及其属支，A组大鼠切取长约4～5cm的股静脉及主要属支，B组于造模后0.5h，C组于造模后72h，D、H组于造模后120h，E、F、G三组于造模后168h分别取与A组相同长度的股静脉。切取近端长0.5cm的血管用于病理学检测，剩余血管用0.9％生理盐水冲洗干净，并在离体30s内放入冻存管，置入液氮罐-197℃保存，每组标本提取20条股静脉血管用于总RNA提取。4、将提取的各组股静脉进行同组标本混合后，用TRIzol法分别提取各组标本总RNA。总RNA样品经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，按照Genechip RatGenome 230 2.0表达谱芯片操作流程，经cDNA探针制备、杂交、洗脱、染色、扫描，完成芯片检测，对所得数据进行分析、归纳、总结。对各组基因进行倍数变化分析、GO功能分类，并对血栓形成高峰期血栓形成组（D组）和不形成组（H组）中的差异表达基因进行Cluster聚类分析。结果1、150只SD大鼠共死亡18只，死亡原因为股动静脉破裂失血性休克（8只）、感染（7只）及麻醉意外（3只）。2、本实验中，动物死亡率12％；第120h高峰期血栓形成率50.6％；第168h血栓消退率56.7％；血栓不消退率43.3％；血栓不形成率44.6％。3、上述各关键时相点8份标本总RNA无降解，质量好。芯片杂交信号强度满意，相关技术证实结果可靠；4、Genechip Rat Genome 230 2.0表达谱芯片所检测的大鼠31042条基因中：B组与A组比较（BvsA），差异表达基因349条，上调214条，下调135条；C组与A组比较（CvsA），差异表达基因2393条，上调1386条，下调1007条；D组与A组比较（DvsA），差异表达基因1743条，上调945条，下调798条；H组与A组比较（HvsA），差异表达基因2790条，上调1685条，下调1105条；E组与A组比较（EvsA），差异表达基因1913条，上调1222条，下调691条；F组与A组比较（FvsA），差异表达基因2564条，上调1535条，下调1029条；G组与A组比较（GvsA），差异表达基因1849条，其中下调1235条，下调614条。高峰期时相点D组与H组比较（DvsH），差异表达基因共805条，上调51条，下调755条。各时相点差异表达基因Go功能分类，主要涉及细胞凋亡、分子黏附、代谢、细胞周期、信号转导等。5、D组与H组比较（DvsH），明显差异表达基因（Signal Log2 Ratio≥2和Signal Log2Ratio≤-2）共195条，其中D组表达量较H组明显升高的基因有5条，分别为：Serpinb2（丝氨酸蛋白酶抑制因子B族成员2），LOC291844，1377655at，1385043at，1394126at；而D组表达量较H组明显降低的基因有190条，基因功能主要涉及纤溶，信号转录，细胞增值、分化和凋亡，细胞骨架，血管平滑肌运动及迁移等方面。6、对DvsH组中明显差异表达基因进行Cluster聚类分析，发现部分呈现明显共表达的基因，这些基因是：①与抗纤溶基因Serpine1（PAI-1）共表达的基因有8条，分别是：Jun，Junb，Btg2，RGD1310800predicted，RGD1307235predicted，Eif4ebp2predicted，1377117at，1398620at。②与促纤溶基因Plaur共表达的基因有23条，分别是：Dusp1，Mylk，Cebpd，Glg1，Kns2，Usf2，Ccnd2，Cdh13，Itga1，Nedd4a，Igsf4bpredicted，Snx11predicted，RGD1308805predicted，1374974at，1393167at，1379897at，1371329at，1385925at，1385704at，1392361at，1382565at，1375362at，1390116at。③以Timp3为代表的共表达基因有3条，分别是：Timp3、Gna15，Lasp1．结论1、创伤后股静脉血管差异基因表达主要涉及纤溶、细胞凋亡、分子黏附、代谢、细胞周期、信号转导等方面，说明这些生物学过程在创伤性深静脉血栓形成中具有重要作用。2、创伤性深静脉血栓高峰期血栓形成明显差异表达基因多数涉及细胞凋亡和分子黏附等；血栓形成与不形成组对比中，5条明显上调基因分别为Serpinb2、Rn．18307、Rn．32617、Rn．136393、1377655at，除Serpinb2为纤溶相关基因外，其余4条为未知功能基因，其功能有待进一步证实。3、纤溶相关基因PAI-1和Plaur，通过介导t-PA和u-PA的变化而在创伤性深静脉血栓形成中起重要作用；4、1377117at、RGD1310800predicted、RGD1307235predicted、1398620at等4条未知功能基因与抗纤基因PAI-1共表达，推测可能具有抑制纤溶的作用。

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