论文摘要
目的：研究流感病毒（H1N1）感染人体免疫细胞的致病机制,并在此基础上研究抗流感病毒药物槲皮素（quercetin）与奥司他韦（oseltamivir）于不同作用时间对流感病毒在感染细胞中增殖的影响及其机制,为研发新型抗流感病毒药物提供实验依据。方法：1.从新鲜正常人脐带血中分离出单核细胞,再诱导为树突状细胞（DC）、巨噬细胞并进行鉴定。2.流感病毒H1N1 A/E13用鸡胚尿囊腔接种法进行扩增,并测定TCID50;再用100TCIDso H1N1 A/E13感染人支气管上皮细胞16HBE细胞株,建立流感病毒感染的细胞模型。3.采用MTT方法检测槲皮素、奥司他韦对流感病毒体外抑制作用及其时效关系（24h、48h、72h）,探讨槲皮素与奥司他韦体外抗流感病毒的效果和特点,确定药物抗病毒最佳浓度。4.观察槲皮素、奥司他韦对流感病毒感染巨噬细胞释放NO水平的影响：将巨噬细胞与流感病毒感染模型共培养,并加入槲皮素、奥司他韦,分别于6h、12h、24h、48h收集各组细胞上清,用硝酸还原酶法检测各组NO水平。5.分别将DC、巨噬细胞与流感病毒感染的细胞模型进行共培养,将槲皮素、奥司他韦作为治疗药物,于24h、48h收集免疫细胞,用实时荧光定量PCR反应（RT-qPCR）测定病毒感染前后以及使用抗病毒药物后DC、巨噬细胞TLR7信号传导通路中各信号蛋白：Toll样受体7（Toll-like receptor 7, TLR7）、髓样分化因子88（myeolid differentiationfactor 88, MyD88）、白细胞介素-1受体相关激酶（IL-1 receptor associated kinase 4,IRAK4）、肿瘤坏死因子相关激酶6 （TNF receptor associated kinase 6, TRAF6）和核因子-κB （nuclear factor-KB p65, NF-κB p65） mRNA的表达。6.分别将DC、巨噬细胞与流感病毒感染的细胞模型进行共培养,将槲皮素、奥司他韦作为治疗药物,于24h收集免疫细胞,用Western-bolt方法检测病毒感染前后以及使用抗病毒药物后DC、巨噬细胞TLR7、NF-κB p65蛋白的表达。结果：1.成功从人脐带血中分离诱导出树突状细胞、巨噬细胞。2.鸡胚尿囊腔接种法成功扩增出流感病毒；血凝试验测得病毒滴度1：640;根据实验结果,按Reed-Muench法计算流感病毒的TCID50=5×10-4.56。3.MTT试验证实槲皮素具有与奥司他韦相同的抗流感病毒作用,并测得两种药物的最适药物浓度。4.流感病毒感染可致巨噬细胞释放NO水平升高,槲皮素与奥司他韦作用于流感病毒感染后的巨噬细胞,在6h、12h、24h、48h均可明显的下调活化巨噬细胞释放NO水平。5. RT-qPCR实验证明流感病毒感染可上调树突状细胞、巨噬细胞TLR7信号传导通路各蛋白mRNA的表达；使用槲皮素与奥司他韦治疗后可显著下调病毒感染的树突状细胞、巨噬细胞TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6、NF-κB mRNA的表达水平。6. Western-blot实验进一步证明病毒感染可致TLR7、NF-κB p65蛋白表达增高,使用槲皮素与奥司他韦治疗后可下调TLR7、NF-κB p65蛋白表达。结论：流感病毒感染可致体外培养的树突状细胞和巨噬细胞TLR7信号传导通路活化,槲皮素与奥司他韦可发挥抗流感病毒的作用,并下调TLR7信号传导通路的活化。