腐烂苹果中真菌分离鉴定和PCR快速检测及条件优化

论文摘要

苹果浓缩汁中棒曲霉素超标一直是影响整个浓缩汁行业的一个主要问题,其根本来源为苹果中的棒曲霉素产生菌。随着国际上相关标准的不断提高,如何控制减少果汁中的棒曲霉素含量,成为各生产厂家迫切需要解决的主要问题。本试验从陕西不同苹果产区采集腐烂富士苹果,以这些腐烂苹果为试材,分离、鉴定其中的真菌,采用PCR方法对这些菌进行了快速检测,优化了PCR的检测条件,建立了普通PCR和实时PCR快速检测的方法,主要获得了以下试验结果:1从不同产地共分离得到216株真菌,其中扩展青霉和矮棒曲霉最多,皮落青霉、黄柄曲霉次之,圆弧青霉、黑曲霉较少。此外,还有少量其它霉菌。2以扩展青霉为试验样品,普通PCR中DNA浓度的检测限约为2.9×10-3ug/mL,孢子液的最低检测限为15cfu/mL;实时PCR中DNA浓度的检测限约为2.07×10-5ug/mL,比普通PCR提高了100倍以上。3对分离到的真菌进行普通PCR检测,获得以下结果:（1）以分离到的真菌为试验样品,进行了PCR快速检测,均获得了清晰地目的条带,效果良好;（2）将真菌样品接种到苹果上不经过分离培养进行PCR检测,结果表明苹果样品对试验结果没有干扰;（3）将分离到的真菌样品不经DNA提取直接进行PCR扩增,结果表明不能获得目的条带。4以扩展青霉为例,进行了反应条件的研究,当退火温度在51℃-61℃范围内,普通PCR和实时PCR均可扩增出良好的目的条带,表明在此试验条件下具有良好的适应范围;引物浓度在0.2uM—1.0uM范围内实时PCR可以获得良好的扩增,且未产生明显的非特异性扩增。本研究获得的试验结果为果园的前期防治,采摘后苹果的防腐控制及果汁的前期加工提供了一定的理论指导,可以为加工前对棒曲霉素产生菌进行控制提供依据,进而从根本上杜绝棒曲霉素的产生。所建立的PCR快速检测方法,可以在前期对棒曲霉素产生菌进行快速检测,可用于商品果汁和苹果汁工业化生产中Penicillium expansum的快速检测和质量控制,亦可作为其它微生物实时PCR检测的方法学参考。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 苹果及苹果浓缩汁概述
• 1.2 苹果浓缩汁生产中的主要问题
• 1.2.1 存在的主要质量问题
• 1.2.2 棒曲霉素的结构及理化性质
• 1.2.3 棒曲霉素的毒性及限量
• 1.2.4 棒曲霉素的检测、控制措施
• 1.3 真菌的形态学观察
• 1.3.1 基本原理
• 1.3.2 基本观察方法
• 1.3.3 真菌形态学特征
• 1.4 微生物快速检测技术概论
• 1.4.1 食品安全快速检测技术的重要性
• 1.4.2 微生物快速检测技术
• 1.5 PCR 技术在微生物检测中的应用概述
• 1.5.1 PCR 的原理
• 1.5.2 PCR 及其相关技术概述
• 1.5.3 实时PCR 技术原理
• 1.5.4 PCR 技术在食品检验检疫中的应用
• 1.6 研究意义、内容与技术路线
• 1.6.1 研究意义
• 1.6.2 研究内容
• 1.6.3 技术路线
• 第二章 腐烂苹果中的真菌分离与鉴定
• 2.1 试验材料、试剂及主要仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 样品处理
• 2.2.2 菌体培养
• 2.2.3 真菌分离纯化
• 2.2.4 菌种记录、保存
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 腐烂苹果中棒曲霉素产生菌的主要种类
• 2.3.2 不同产地腐烂苹果中棒曲霉素产生菌的差异
• 2.4 讨论
• 第三章 PCR 法快速检测苹果中真菌
• 3.1 材料、试剂与主要仪器
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 菌种的培养
• 3.2.2 DNA 的提取
• 3.2.3 PCR 反应条件
• 3.2.4 产物检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 退火温度对扩展青霉3.5425 PCR 结果的影响
• 3.3.2 PCR 检测灵敏度
• 3.4 讨论
• 第四章 扩展青霉实时PCR 条件优化
• 4.1 材料、试剂及主要仪器
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 菌种的培养
• 4.2.2 DNA 的提取
• 4.2.3 PCR 反应条件
• 4.2.4 产物检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 退火温度对扩展青霉3.5425 实时 PCR 结果的影响
• 4.3.2 引物浓度对扩展青霉3.5425 实时PCR 结果的影响
• 4.3.3 实时PCR 灵敏度检验
• 4.4 讨论
• 第五章 结论与创新点
• 5.1 结论
• 5.2 创新点
• 参考文献
• 附录本研究使用的主要溶液、培养基的配制
• 致谢
• 个人简介