论文摘要
铁作为人体必需的微量元素，广泛参与体内的代谢过程，其含量下降可影响血红蛋白的合成，进而影响红细胞的形成，甚至引起贫血。世界卫生组织报道全世界患贫血人数高达20亿，引发贫血的主要原因是铁摄入不足，但我们的前期研究发现在膳食铁供给充足的情况下，心理应激可以降低血清铁浓度并影响红细胞生成。而产生这种影响的机制仍需进一步研究。肝脏是机体主要的铁贮存部位，同时在铁稳态的调节中起着中心和枢纽作用，铁调素等许多重要的铁代谢相关蛋白都是肝脏特异性合成分泌的。铁缺乏和铁过量对机体都将产生不良影响，因此，机体需要具有严格的铁调控机制，既可提供足量的铁来发挥其生理功能，又可防止因过量而产生铁毒性，从而维持体内和细胞内的铁平衡。铁过负荷可以在组织、细胞以及细胞器水平引起脂质过氧化，非蛋白结合铁能通过Fenton反应产生羟自由基，攻击细胞膜上的不饱和脂链，铁蛋白中的三价铁被还原成为二价铁离子引起脂质过氧化反应，在氧自由基的形成中起着重要作用。国内外许多临床研究发现，某些疾病与肝铁代谢异常有密切的联系，如慢性炎症性贫血、酒精性肝炎、肝硬化、遗传性血色素沉着病均发生了不同程度的肝铁代谢紊乱。IL-6是炎症状态下通过诱导肝脏分泌铁调素增加引起低铁血症的必要条件，相反地中海贫血的患者肝脏分泌铁调素减少，而在心理应激情况下，肝脏铁代谢在血清铁下降的同时发挥怎样的作用，肝脏铁代谢发生了哪些改变以及发生这些改变的分子机制研究未见报道。现代社会生活和学习工作的负担常常使人们处于心理应激状态。通过进一步研究阐明心理应激对肝铁代谢的影响，对于全面了解贫血产生的原因，完善贫血的预防和治疗措施具有积极的意义。第一部分：心理应激对肝铁浓度和氧化应激反应的影响目的：观察心理应激对肝脏铁含量和氧化应激反应的影响。方法：心理应激模型制作：雄性SD大鼠按体重随机分为空白对照组、心理应激组和足底电击组。采用Communication Box System制作心理应激大鼠模型，每日一次，持续时间每次30min，实验周期分别为1d，3d、7d和14d。指标测定：应用原子吸收法测定肝组织铁浓度；BPS法测定非蛋白结合铁浓度，Perl’s法进行肝组织铁染色；应用酶联免疫法检测铁蛋白表达水平。图象分析及数据统计：实验数据用（x±s）表示，数据统计处理应用统计软件SPSS 12．0，统计方法采用方差分析。结果：1．心理应激对肝铁浓度的影响与对照组相比，7d和14d心理应激大鼠肝铁浓度，铁蛋白表达和非蛋白结合铁浓度均明显增加（P<0．05）；心理应激组和足底电击组相比，没有显著性差异（P>0．05）。Perl’s铁染色显示，与对照组比较，7d和14d心理应激组和足底电击组大鼠肝组织铁染色明显增加，铁沉积主要分布在肝细胞、内皮细胞和巨噬细胞。2．心理应激对氧化应激反应的影响与对照组相比，7天和14天心理应激组超氧化物歧化酶活性和丙二醛浓度明显升高（P<0．05）。心理应激组和足底电击组相比，没有显著性差异（P>0．05）。第二部分：心理应激影响肝铁代谢的分子机制目的：探讨心理应激影响肝脏铁获取和铁释放的分子调节机制。方法：指标测定方法：应用蛋白免疫印迹法检测铁调素（hepcidin）、膜铁转运蛋白（FP1）、转铁蛋白受体2（TfR2）蛋白表达；应用酶联免疫法检测转铁蛋白受体1表达水平。图象分析及数据统计：采用ImageJ图像分析系统进行灰度分析，实验数据用（x±s）表示，数据统计处理应用统计软件SPSS 12．0，统计方法采用方差分析和Pearson相关分析。结果：1．心理应激对肝脏铁代谢相关蛋白的影响与对照组相比，心理应激组3d后出现肝脏hepcidin和TFR2蛋白表达持续上调，FP1蛋白表达持续下调（P<0．05）。肝脏TfR1蛋白表达在7d和14d下调（P<0．05）。心理应激组和足底电击组相比，没有显著性差异（P>0．05）。2．心理应激大鼠肝铁浓度与hepcidin的关系肝脏hepcidin蛋白表达与肝脏铁浓度存在正相关（P<0．05）。Hepcidin升高先于肝铁浓度改变，提示心理应激诱导的肝脏hepcidin表达升高是引起机体铁代谢紊乱的重要原因。第三部分：心理应激大鼠hepcidin变化的调节因子研究目的：阐明IL-6-hepc轴在心理应激大鼠铁代谢紊乱中的作用。方法：实验动物处理：雄性SD大鼠按体重随机分为空白对照组、心理应激生理盐水组，足底电击生理盐水组，心理应激IL-6抗体组，足底电击IL-6抗体组。采用Communication Box System制作心理应激大鼠模型，每日一次，持续时间每次30min，实验周期分别为3d、7d。指标测定方法：应用原子吸收法测定血清铁和肝组织铁浓度；应用蛋白免疫印迹法检测肝铁调节机制中的重要调节蛋白hepcidin、FP1蛋白表达；应用酶联免疫法检测IL-6、TNF-α和IL-10表达水平。图象分析及数据统计：采用ImageJ图像分析系统进行灰度分析，实验数据用（x±s）表示，数据统计处理应用统计软件SPSS 12．0，统计方法采用方差分析和Pearson相关分析。结果：1．心理应激对细胞因子表达的影响与对照组相比，心理应激组3d开始出现肝脏IL-6和TNF-α蛋白表达持续升高（P<0．05），IL-10蛋白表达没有显著性差异（P>0．05）。大鼠肝脏IL-6与hepcidin蛋白表达密切相关（P<0．05）。2．IL-6抗体抑制心理应激大鼠IL-6表达上调与生理盐水组相比，心理应激IL-6抗体组大鼠血清IL-6表达水平明显降低（P<0．05），与对照组相比，心理应激IL-6抗体组和足底电击IL-6抗体组大鼠血清IL-6表达水平没有显著性差异（P>0．05）。3．IL-6抗体对心理应激大鼠铁分布的影响与生理盐水组相比，心理应激IL-6抗体组3d和7d血清铁浓度明显升高，7d肝铁浓度明显降低（P<0．05），与对照组相比，心理应激IL-6抗体组和足底电击IL-6抗体组3d和7d血清铁、7d肝铁浓度没有显著性差异（P>0．05）。4．IL-6抗体对心理应激大鼠肝脏铁代谢相关蛋白表达的影响与生理盐水组相比，心理应激IL-6抗体组大鼠肝脏hepcidin蛋白表达降低，FP1蛋白表达升高（P<0．05），与对照组相比，心理应激IL-6抗体组和足底电击IL-6抗体组大鼠肝脏hepcidin和FP1蛋白表达没有显著性差异（P>0．05）。结论：1．心理应激可导致肝脏铁储存升高和血清铁下降，肝脏以铁蛋白和含铁血黄素的形式储存铁增加；同时肝脏非蛋白结合铁浓度增加，并伴随脂质过氧化反应增强；随着应激时间延长，肝脏铁储存持续升高，血清铁浓度持续下降，肝铁浓度升高可能是血清铁浓度下降的原因之一。2．心理应激可诱导肝脏转铁蛋白受体2表达上调，而肝脏转铁蛋白受体1蛋白表达下调，提示心理应激条件下肝脏铁储存增加可能是通过转铁蛋白受体2摄取的；同时出现肝脏hepcidin蛋白表达上调与FP1表达下调，机体铁的循环再利用过程中巨噬细胞铁释放减少。3．肝脏hepcidin蛋白表达与肝铁浓度存在正相关，hepcidin表达上调先于肝铁浓度升高，提示心理应激所导致的肝脏hepcidin表达升高是引起了铁代谢的变化的原因；心理应激诱导IL-6和hepcidin蛋白表达持续上调，两者变化的时间和趋势一致，肝脏hepcidin与IL-6蛋白表达存在正相关。4．IL-6抗体使心理应激大鼠肝脏和血清铁分布趋于正常，并抑制应激大鼠肝脏hepcidin蛋白表达升高以及FP1蛋白表达的降低。IL-6-hepc轴是导致心理应激大鼠机体铁代谢紊乱的主要通路。